This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
מודלים של בעלי חיים ניסיוניים של שבץ הם כלים רבות ערך להבנת הפתולוגיה שבץ ופיתוח אסטרטגיות טיפול יעילים יותר. פרוטוקול 2 שבוע לנפשי מראש חוסר חמצן חוזר (RHP) גורם הגנה לטווח ארוך מפני פגיעה במערכת עצבים מרכזית (CNS) במודל של עכברים של שבץ איסכמי מוקדי. RHP מורכב של 9 חשיפות סטוכסטיים להיפוקסיה שמשתנות בשני המשך (2 או 4 שעות) והעצמה (8% ו -11% O 2). RHP מפחית כרכי אוטם, הפרעה דם-מוח מכשול (BBB), ותגובה הדלקתית השבץ-פוסט לשבועות בעקבות החשיפה האחרונה להיפוקסיה, המצביע על אינדוקציה ארוכת טווח של פנוטיפ CNS-מגן אנדוגני. המתודולוגיה לכימות הכפול של אוטם נפח ושיבוש BBB היא יעילה בהערכת הגנת עצבים וכלי דם בעכברים עם RHP או neuroprotectants המשוער אחר. עכברים השוויצריים וובסטר מבוגר גברים היו מותנים מראש על ידי RHP או חשיפות משך-שווה ערך ל 21% O <sub> 2 (אוויר חדר כלומר). חסימת 60 דקות חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) הייתה מושרה 2 שבועות בעקבות חשיפת חוסר חמצן האחרונה. שתי החסימה וreperfusion אושרו על ידי Flowmetry דופלר לייזר transcranial. עשרים ושתיים שעות לאחר reperfusion, אוונס הכחול (EB) הייתה בהזרקה לוריד דרך הזרקה לוריד זנב. 2 שעות מאוחר יותר, בעלי החיים הוקרבו על ידי סעיפי יתר ומוח isoflurane הוכתמו כלוריד 2,3,5- triphenyltetrazolium (TTC). כרכי אוטמים אז היו לכמת. בשלב הבא, EB הופקה מהרקמה מעל 48 שעות כדי לקבוע הפרעה BBB לאחר tMCAo. לסיכום, RHP הוא פרוטוקול פשוט שניתן לשכפל, עם עלות מינימאלית, כדי לגרום להגנה לטווח ארוך אנדוגני עצבים וכלי דם מפציעה שבץ בעכברים, עם פוטנציאל translational למצבי מחלה פרו-דלקתיים אחרים המבוססים על מערכת העצבים המרכזית ומערכתיים.
כגורם המוביל למוגבלות מבוגרים והגורם המוביל הרביעי של מוות, שבץ הוא אחת מדינות המחלה המתישות ביותר העומדות בפני האוכלוסייה הבוגרת בארצות הברית. מודלים של בעלי החיים 1 לשבץ לאפשר לחקירה ניסיונית של שיטות חדשות לצמצום פגיעת איסכמית ו שיפור התאוששות שבץ-פוסט. שדרת רומן אחד למחקר translational כזה נפשית מראש. אכשור קד הוא השימוש המכוון של גירוי נזק הלא-מנת להפחית את הנזק שמלאחר מכן, וחמורה יותר, פציעה. 2 נפשית מראש חוסר חמצן הוכח לייצר שינויי pleiotropic במוח המספקים הגנה מפני שבץ בשני in vivo ובניסויים במבחנה . 3 עם זאת, חשיפה יחידה להיפוקסיה מציעה רק neuroprotection לטווח קצר, וישכנע פחות מ -72 שעות של סובלנות נגד איסכמיה בעכברים בוגרים. 4 גם לאחר ארבעה שבועות של חשיפות יומיות 14 שעות להיפוקסיה hypobaric, לין ואח '. FOund neuroprotection שספג רק לנפשי מראש אחד בשבוע. 5 חוזרים חוסר חמצן (RHP) מאופיין בסטיות אקראיות בתדירות, משך, ועוצמת חשיפות חוסר חמצן. בניגוד לאתגר נפשית מראש יחיד, RHP גורם פנוטיפ cerebroprotective שנמשך עד שמונה שבועות בעכברים. 6 RHP מופחת כרכי אוטם, מחסום דם-מוח הפרעה (BBB), דלקת של כלי דם, וdiapedesis יקוציט במשך שבועות לאחר חשיפת חוסר חמצן הסופית . RHP מופחת במיוחד דלקת במוח איסכמי על ידי הפחתה של תאי T, מונוציטים, ואוכלוסיות מקרופאג, תוך שמירה על אוכלוסיות תאי B בחצי כדור איסכמי. 7 למעשה, RHP מושרה פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית בעכברים לפני כל פגיעה במערכת העצבים המרכזית, כולל שבץ. תאי B שטופל RHP המבודדים מעכברים בריאים שטופל RHP הציגו פנוטיפ אנטי דלקתי ייחודי, עם downregulation של שתי מצגת אנטיגן וייצור נוגדנים.ירידה כללית במנגנונים חיסוניים אדפטיבית פרו-דלקתיים גורמת RHP מתודולוגיה מצוינת לגרום לדיכוי חיסוני אנדוגני למחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ספציפיות לא רק, אלא גם דגמי פציעה או מחלה מערכתיות הכוללים פתולוגיה פרו-דלקתית.
RHP מפחית שני האוטם הבא חסימה חולפת אמצע מוחי עורק (tMCAo) נפח ושיבוש BBB. מודלים של בעלי חיים של שבץ, כגון tMCAo הנפוץ, לשפר באופן דרמטי את ההבנה של הפתופיזיולוגיה של שבץ, כמו גם את העיצוב של Neurotherapeutics היעיל יותר. ראשון שפותח על ידי אל קואיזומי et., בשנת 1986, 8 הליך tMCAo הוא שיטה נפוצה של גרימת שבץ במכרסמים ואחת מהשיטות המועדפות לחקירת הדלקת הבאה reperfusion. כשיטות לtMCAo להתפתח, השימוש עדכנית יותר של חוטים מצופים סיליקון לצמצם עוד יותר את הסיכון לדימום תת-עכבישים בהשוואה לדגמים אחרים 9,10 </ Sup> ולשפר את האמינות, אם כי למרבה הצער tMCAo לעתים קרובות מייצר וריאציה רחבה בכמויות אוטם. 11-13 רוב המחקרים האלה להתוות אזורי אוטם בחלקים במוח עטרה על ידי צביעה עם כלוריד triphenyltetrazolium 2,3,5- (TTC), נחשב תקן זהב לכימות אוטם כי זה הוא דרך פשוטה וזולה כדי לייצר תוצאות חיות, לשכפול. TTC משמש כמצע של dehydrogenases הנוכחי במיטוכונדריה. כאשר פרוסות מוח נחשפות לפתרון TTC, TTC נלקח באופן סלקטיבי לתאים חיים שבו המוצר שלה שאינן מסיס בהפחתה, formazan, שוקע לצבע אדום עמוק במיטוכונדריה קיימא. בגלל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ברקמה איסכמית, רקמה זו נשארה לבנה, המאפשרת להתמיינות של רקמות פגועות ובריאים. 14
RHP גם מפחית הפרעה BBB בחצי כדור איסכמי. 6 לכן, הכימות הכפול של שלמות BBB בתוך אותה בגשמים כמבוססים TTC נפח אוטם קביעות 15 היו לספק מידע שימושי על היעילות המלאה של הגנת אנדוגני, וקשרים סיבתיים אפשריים בין ההפרעה BBB ואוטם בבעלי חיים שלא טופלו ומטופלים. הזרם של דם היקפי באמצעות BBB שיבש, המשני לשבץ, מגביר אוכלוסיות יקוציט, ציטוקינים פרו-דלקתיים, סטרס חמצונים, בצקת vasogenic, ושינוי המורגי בחצי כדור איסכמי, סופו של דבר להגדיל את שיעורי זיהום ותמותה בחולים עם שבץ איסכמי . 16,17 שיטה נפוצה למדידת ההפרעה BBB במודלים של בעלי חיים היא דרך כימות של אוונס כחול דליפת צבע (EB) לתוך המוח. 15,18-21 EB נקשר באופן סלקטיבי לסרום אלבומין, חלבון כדורי (MW = 65 KDA) שלא לחצות את BBB בבעלי החיים ללא כל פגע. 22 בעקבות שבץ איסכמי, EB מחלחלת למוח, ומאיר ב620 ננומטר, המאפשרת למדידת צפיפות האופטית within perfused parenchyma נפצע. 22 הצפיפות האופטית היא ביחס ישר לחדירות של BBB כאשר EB כבר דהויה של כלי הדם בקליפת המוח שלאחר המוות על ידי זלוף transcardiac. עם העיבוד המיידי של מוח הצבעוני TTC בבעלי חיים עם ממשל EB, שני נפח האוטם ושיבוש BBB ניתן לכמת בצורה יעילה. יש לציין, עם זאת, כי פגיעה עצבית וההפרעה BBB אינם תהליכים מקבילים במוח השבץ-פוסט, 23,24 כך את הבחירה של זמן של הקרבה הוא שיקול חשוב.
הפרוטוקול שלהלן מפרט את שיטת RHP, שיטת tMCAo גרימת חסימת עורקים זמנית שמודלי חסימות אמצע מוחי עורק בחולים אנושיים, ושיטות היסטולוגית הכפולה לקביעת נקודות קצה פציעת שבץ עצבית וכלי דם. TTC מודד מוות של תאים ונזק לרקמות מצטברות, המאפשר לכימות של כרך אוטם כוללUme, בעוד EB מספקת לכימות חצאי המוח של נזק BBB.
חשיפה יחידה להיפוקסיה המערכתית (כלומר, 2 שעות של 11% O 2) בעכברים "זמני" מגנה על המוח מפני tMCAo, 29 כלומר התגובה אפיגנטיים לאתגר נפשית מראש חוסר חמצן הוא קצר-טווח, ואת הפנוטיפ הבסיס משוחזר ב ימים. מצגות חוזרות ונשנות של הגירוי נפשית מראש חוסר חמצן באופן ?…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |