This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.
النماذج الحيوانية التجريبية من السكتة الدماغية هي أدوات لا تقدر بثمن لفهم السكتة الدماغية علم الأمراض وتطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. بروتوكول 2 أسبوع لتكرار شروط مسبقة ميتة (رهب) يدفع حماية طويلة الأمد ضد الجهاز العصبي المركزي (CNS) إصابة في نموذج الفأر من السكتة الدماغية التنسيق. يتكون رهب من 9 التعرض لنقص الأكسجين العشوائية التي تختلف في كل مدة (2 أو 4 ساعات) وكثافة (8٪ و 11٪ O 2). RHP يقلل كميات احتشاء، حاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب، والاستجابة الالتهابية في مرحلة ما بعد السكتة الدماغية لعدة أسابيع بعد آخر تعرض لنقص الأكسجين، مما يشير إلى الحث على المدى الطويل من النمط الظاهري CNS واقية الذاتية. منهجية لتقدير مزدوج من حجم احتشاء وBBB اضطراب فعالة في تقييم الحماية الوعائية العصبية في الفئران مع RHP أو neuroprotectants المفترض الآخرين. وقد اشترطت الذكور البالغين فئران وبستر السويسرية التي كتبها رهب أو التعرض المدة أي ما يعادل 21٪ O <suب> 2 (أي هواء الغرفة). وكان المستحث A 60 دقيقة عابرة وسط انسداد الشريان الدماغي (tMCAo) 2 أسابيع بعد التعرض ميتة الماضي. وقد أكد كل من انسداد وضخه من قبل عبر الجمجمة دوبلر الليزر flowmetry. اثنان وعشرون ساعة بعد ضخه، ايفانز الأزرق (EB) كانت تدار عن طريق الوريد من خلال حقن الوريد الذيل. في وقت لاحق 2 ساعة، تم التضحية الحيوانات عن طريق أقسام جرعة زائدة والدماغ الأيزوفلورين كانت ملطخة 2،3،5- كلوريد triphenyltetrazolium (TTC). ثم تم كميا كميات عوائق. بعد ذلك، تم استخراج EB من النسيج على مدار 48 ساعة لتحديد BBB اضطراب بعد tMCAo. باختصار، RHP هو بروتوكول بسيط يمكن تكرارها، بأقل تكلفة ممكنة، للحث على حماية الوعائية العصبية الذاتية على المدى الطويل من الاصابة بجلطة في الفئران، مع احتمال متعدية للدول مرض الموالية للالتهابات المستندة إلى الجهاز العصبي المركزي وجهازية أخرى.
باعتبارها السبب الرئيسي للعجز الكبار ورابع سبب رئيسي للوفاة، والسكتة الدماغية هي واحدة من الحالات المرضية الأكثر إضعافا التي تواجه السكان البالغين في الولايات المتحدة. 1 النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية تسمح التحقيق التجريبي للطرق جديدة لتقليل الإصابة الدماغية و تحسين الانتعاش بعد السكتة الدماغية. واحد سبيلا جديدا لهذه البحوث متعدية غير شروط مسبقة. شروط مسبقة هو الاستخدام المتعمد للحافزا غير ضارة للحد من الأضرار من لاحقة، وأشد، والإصابة. وقد تبين أن 2 نقص الأوكسجين شروط مسبقة لإحداث تغييرات عديد المظاهر في الدماغ التي توفر الحماية من السكتة الدماغية في كل المجراة في الدراسات المختبرية 3 ومع ذلك، فإن التعرض لنقص الأكسجين واحد لا يقدم سوى العصبية على المدى القصير، وحمل أقل من 72 ساعة من التسامح ضد نقص التروية في فئران بالغة. 4 وحتى بعد أربعة أسابيع من التعرض اليومية 14 ساعة لنقص الأكسجين منخفض الضغط، ولين وآخرون. FOاوند أن العصبية واستمر فقط لمدة أسبوع واحد. 5 شروط مسبقة ميتة المتكرر (رهب) تتميز التغيرات العشوائية في التردد، والمدة، وشدة التعرض ميتة. على النقيض من التحدي شروط مسبقة واحد، RHP يدفع النمط الظاهري cerebroprotective أن تستغرق ما يصل إلى ثمانية أسابيع في الفئران. 6 تخفيض RHP كميات احتشاء، حاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب، والتهاب الأوعية الدموية، والكريات البيض انسلال لعدة أسابيع بعد التعرض ميتة النهائي . RHP انخفاض تحديدا التهاب في الدماغ الدماغية عن طريق الحد من الخلايا التائية، الوحيدات، والسكان بلعم، مع الحفاظ على السكان الخلية B في نصف الكرة الدماغية. 7 في الواقع، بفعل RHP النمط الظاهري المثبطة للمناعة في الفئران قبل أي إصابة الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك السكتة الدماغية. خلايا B RHP المعاملة معزولة عن رهب معاملة الفئران صحي أظهرت النمط الظاهري المضادة للالتهابات فريدة من نوعها، مع downregulation من كل من العرض مستضد وإنتاج الأجسام المضادة. الانخفاض عام في الآليات المناعية التكيفية الموالية للالتهابات يجعل RHP منهجية ممتازة للحث على المناعة الذاتية للأمراض التهابات الجهاز العصبي المركزي محددة فحسب، ولكن أيضا الإصابة أو المرض النماذج الشاملة التي تشمل أمراض الموالية للالتهابات.
RHP يقلل من حيث الحجم واحتشاء BBB اضطراب بعد منتصف انسداد الشريان الدماغي عابر (tMCAo). نماذج حيوانية من السكتة الدماغية، مثل شائعة الاستخدام tMCAo، وتحسين كبير في فهم الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية، فضلا عن تصميم neurotherapeutics أكثر فعالية. أول من وضعه كويزومي وآخرون، في عام 1986، 8 الإجراء tMCAo هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع على إحداث سكتة دماغية في القوارض واحدة من الطرق المفضلة للتحقيق في التهاب التالية ضخه. وطرق لtMCAo تتطور، واستخدام أحدث من خيوط المغلفة سيليكون كذلك يقلل من خطر النزف تحت العنكبوتية مقارنة بالطرازات الأخرى 9،10 </ سوب> وتحسين الاعتمادية، على الرغم من سوء الحظ tMCAo غالبا ما تنتج عن اختلاف كبير في حجم احتشاء 11-13 معظم هذه الدراسات تحدد المناطق احتشاء في أقسام الدماغ الاكليلية التي تلطيخ مع 2،3،5- triphenyltetrazolium كلوريد (TTC)، يعتبر المعيار الذهبي لاحتشاء الكمي لأنه هو وسيلة بسيطة وغير مكلفة لإنتاج حية، نتائج قابلة للتكرار. يقدم TTC باعتباره ركيزة من dehydrogenases الموجودة في الميتوكوندريا. عندما يتعرض شرائح الدماغ إلى حل TTC، يؤخذ TTC بشكل انتقائي في الخلايا الحية حيث المنتج الحد غير قابل للذوبان في، formazan، يترسب إلى لون أحمر عميق في الميتوكوندريا قابلة للحياة. بسبب ضعف الميتوكوندريا في الأنسجة الدماغية، تبقى هذه الأنسجة البيضاء، مما يسمح للتمايز الأنسجة التالفة وصحية. 14
RHP يقلل أيضا من BBB اضطراب في نصف الكرة الدماغية. 6 لذلك القياس الكمي المزدوج للسلامة BBB ضمن نفس بالأمطار كما حجم احتشاء أساس TTC-15 قرارات من شأنها أن توفر معلومات مفيدة حول فعالية كاملة من الحماية الذاتية، والعلاقات السببية المحتملة بين BBB اضطراب واحتشاء في الحيوانات غير المعالجة أو المعالجة. تدفق الدم المحيطي من خلال BBB تعطلت والثانوي إلى السكتة الدماغية، ويزيد من السكان الكريات البيض، السيتوكينات الموالية للالتهابات، الاكسدة، وذمة وعائية المنشأ، والتحول النزفية في نصف الكرة الدماغية، وزيادة في نهاية المطاف معدلات الإصابة والوفيات في المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية . 16،17 وهناك طريقة شائعة لقياس BBB اضطراب في النماذج الحيوانية من خلال تقدير حجم ايفانز الأزرق (EB) تسرب الصبغة في الدماغ. 15،18-21 EB يربط بشكل انتقائي لمصل الزلال، وهو بروتين كروي (MW = 65 كيلو دالتون) لا عبور BBB في الحيوانات لم يصب. 22 وبعد السكتة الدماغية، EB يخترق الدماغ، وتتفلور في 620 نانومتر، مما يسمح لقياس الكثافة البصرية داخلهان لحمة أصيب perfused ل22 الكثافة البصرية يتناسب طرديا مع نفاذية BBB عندما تم غسلها EB من الأوعية الدموية القشرية بعد الوفاة التي كتبها transcardiac الارواء. مع تجهيز الفوري للأدمغة TTC الملطخة في الحيوانات مع الإدارة EB، فإن كلا من حجم احتشاء وBBB اضطراب يمكن قياس فعالية. وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أن الإصابة العصبية وBBB اضطراب ليست عمليات مصاحبة في المخ بعد السكتة الدماغية، 23،24 حتى اختيار وقت التضحية هو أحد الاعتبارات الهامة.
البروتوكول الذي يلي تفاصيل طريقة رهب، وطريقة tMCAo عن الأمر الذي أدى إلى انسداد الشرايين مؤقت نماذج المتوسطة انسداد الشريان الدماغي في المرضى من البشر، والأساليب النسجية المزدوجة لتحديد العصبية والأوعية الدموية النهاية الإصابة بالسكتة الدماغية. TTC يقيس موت الخلايا وتلف الأنسجة التراكمي، والسماح للالكمي من المجلد احتشاء العامأوميا، في حين يوفر EB لتقدير نصف الكرة الغربي من الضرر BBB.
التعرض مرة واحدة لنقص الأكسجة النظامية (أي 2 ساعة من O 2 11٪) في الفئران "عابر" يحمي الدماغ من tMCAo، 29 وهذا يعني أن استجابة جينية لتحدي شروط مسبقة ميتة قصيرة الأمد، ويتم استعادة النمط الظاهري الأساس داخل أيام. العروض المتكررة من التحفيز شروط مسبقة ميت…
The authors have nothing to disclose.
Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).
Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
15L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8mm diameter probe |
High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
250 mL isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
3mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
0.3cc insulin syringe with 29 g needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
TTC | Sigma | T8877 | |
10X PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
27g winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
1.7 mL microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |