Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
PCR כמותית (QPCR, ראו חומרים נוספים להגדרות של מונחים המשמשים בכתב היד הזה) ולהפוך שעתוק-qPCR (RT-qPCR) הם כלים רבי ערך לאיתור וכימות וירוסי מעיים אנושיים בסביבה ושתיית מים, ובמיוחד לוירוסים רבים שעושים לא לשכפל או לשכפל בצורה גרועה במערכות תרבית תאים. שני הכלים הוכיחו כי סוגים רבים וירוס נמצאים במי שתייה סביבתיים ובעולם 1-6. השימוש בם בשילוב עם רצף של שברים הגנומי מוגברים במהלך חקירות פרוץ מחלה סיפק ראיות להעברת נגיף המועברות במים, כפי שהם הראו כי הנגיף נמצא במי השתייה הוא זהה לסככה שעל ידי חולי פרוץ 7-10.
שני qPCR וRT-qPCR הם כלים בריאות ציבור שימושיים. לדוגמא, נתונים ממחקרים שנערכו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה בארה"ב (EPA) הראו קשר חזק להיותמדידות מחוון tween ידי qPCR והשפעות בריאותיות במים ופנאי. כתוצאה מכך, קריטריוני איכות מים קלים של EPA הסופיים 2,012 כוללים שיטת qPCR לניטור חופי פנאי 11,12. Borchardt ועמיתים מצאו גם קשר חזק בין קיבה ומעיים חריפים בקהילות באמצעות מי תהום ווירוס שלא טופלה בתהום כפי שנמדדו על ידי RT-qPCR 1.
מטרת מאמר זה היא לתאר את רכיב assay המולקולרי של 13,14 EPA השיטה 1,615. assay זה משתמש RT-qPCR לספק הערכה כמותית של enterovirus ועותקי norovirus הגנומי (GC) לליטר המבוסס על הנפח המקורי של מי שתייה או הסביבתי עבר סינון electropositive. סקירה של ההליך המולקולרי מוצגת באיור סעיף 1. פרוטוקול פרטים 1 הנהלים להכנת העקומה סטנדרטית. תקנים אלה הוכנו ממגיבים המכיל RNעותק של רצף המטרה לכל קבוצות פריימר / הבדיקה. סעיף 2 מתאר את הליך ריכוז שלישוני. סעיף 3 נותן את ההליך להפקת RNA מדגימות מים ושליטה מרוכזות. RNA מכל מדגם בדיקה הפוך עיבד באמצעות מבחני בשלושה עותקים ופריימרים אקראיים לראש השעתוק (סעיף 4). CDNA מכל תגובת שעתוק לאחור מחולק לחמישה מבחני נפרדים וירוס ספציפי שמנותחים בשלושה עותקים על ידי qPCR (סעיף 5; איור 2). Assay משתמש פריימרים ובדיקות מהספרות המדעית (טבלת 1) שנועדו לזהות enteroviruses רב וnoroviruses ומגיב מכיל צהבת G RNA לזהות דגימות בדיקה שמעכבות עד 15 RT-qPCR.
מחקרים לאומיים בקנה מידה גדולה של זיהום הנגיפי של מים מקור ושתייה דורשים השימוש במעבדות אנליטיות מרובות. בתנאים אלה יש צורך בשיטה סטנדרטית כדי להבטיח כי הנתונים שנוצרו על ידי מעבדות הרבות הוא דומים. ישנן שיטות רבות שפורסמו מולקולריות לאיתור וירוסים, אבל מעט מאוד שיטות מולקולריות אחידות. EPA שיטה 1,615 היא שיטה סטנדרטית שתוכננה במיוחד עבור זיהוי של enterovirus וnorovirus במטריצות מים על ידי RT-qPCR. שיטות מולקולריות סטנדרטיות זמינות לאיתור וירוסים במזונות (CEN / ISO TS 15,216-1 וCEN / ISO TS 15,216-2; 7 אפריל 2013) 16,17 ויושמו לזיהוי של צהבת וירוס וnorovirus באביב מים 16. כל השיטות סטנדרטי חייבת לכלול בקרת ביצועי איכות וקריטריונים כדי למזער בינלאומי ופנים-וריאציה מעבדה והנתונים חיוביים כוזבים עקב זיהום במעבדה. כדי לצמצם עוד יותר נתונים כוזבים, Eרשות שיטה 1,615 כדלקמן ההדרכה של המשרד לאיכות הסביבה על שיטות מולקולריות, 18 הקובע הפרדת העבודה במהלך עיבוד ודרך אחת זרימת עבודה. הוא כולל G צהבת 1,19 שליטה ונהלים כדי למזער תוצאות שליליות שגויות בשל מעכבים של 15 RT-qPCR פנימיים. היא משתמשת במבחנים כמותיים יחד עם כמויות סטנדרטיות של שני המים שנדגמו והמים ניתחו כך שכל נתוני השדה מתבטאים בעותקים הגנומי לליטר של השדה או שתיית נדגמו מים. למרות שצינור יעיל יחיד (צעד אחד) מבחני RT-PCR זמין מסחרי, בשיטה במכוון משתמשת מבחני נפרדים. זה יש את החסרון של צמצום כמות המדגם שניתן assayed בכל תגובה, אבל נותן גמישות רבה יותר בשימוש בערכות פריימר מרובים. מבחני RT-qPCR מוגבלים על ידי ורק טוב כמו פריימרים ובדיקות בשימוש וסביר לא קבוצת פריימר תהיה לזהות את כל גרסאות הווירוס בתוך קבוצה. סט פריימר enterovirus נבחר בגללהיא פוגעת באזור 5'-שאינו נשמרים קידוד, 20,21 מזהה מגוון רחב של זנים אל enterovirus, ווירוסים שאותרו על ידי זה קשורים להשפעות בריאותיות מצריכה של groundwaters מטופל 1. שתי קבוצות פריימר משמשות לזיהוי של genogroup אני noroviruses 22,23. הראשון נבחר בשל המתאם החזק בין השפעות הבריאותיות בילדים צעירים וזוהה וירוס 1. Genogroup השני אני פריימר להגדיר ולהגדיר פריימר משמש לgenogroup השני noroviruses נבחרו משום שהם מזהים את המגוון הרחב ביותר של זני 24,25.
למרות היתרונות הגדולים של נהלי qPCR וRT-qPCR לאיתור רנ"א הנגיפי במים, יש כמה מגבלות. ראשית, שני חלקיקי הווירוס מדבקים ומידבקים, כוללים אלה מומתים על ידי חומרי חיטוי, יכולים להיות מוגברים על ידי נהלים אלה. התוצאות מצביעות על כך שBorchardt זה פחות בעיה לF groundwaters שלא טופלהאקוויפרים ROM דומים לאלה שביישובים שנבדקו בהשוואה למים עיליים חיטוי 1. לוירוסים culturable בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות PCR בשילוב עם תרבות 26,27. הבעיה גם טופלה במשך כמה וירוסים באמצעות שימוש בסוכני cross-linking חומצות גרעין 28-30. גישה זו אחרונה היא יעילה יותר לוירוסים מומת על ידי היפוכלוריט ולא יעיל למי מומת על ידי UV.
מגבלה שנייה של נהלים המולקולריים אלה היא כי היקף המדגם מרוכז שניתן assayed בדרך כלל הוא הרבה יותר קטן מזה המשמש לנוהלי תרבות 6,31. בעיה זו מטופלת לעתים קרובות על ידי שתי החלפת הליך המבוסס על פוליאתילן גליקול לריכוז הסטנדרטי המשני על ידי הפתתה אורגנית, המאפשר את המדגם כדי להיות resuspended בנפח קטן יותר, או על ידי התוספת של מדגם שיישוני צעד ריכוז 6,32,33 . שיטה 1,615 משתמשת centrifאולטרה ugal לספק ריכוז שלישוני. אולטרה סינון צנטריפוגלי מסיר מים ורכיבים פחות מ -30,000 Daltons וכתוצאה מכך גם הריכוז של כל וירוס בדגימות בדיקה וירידה במשקל מולקולרי קטנים מעכבים של מבחני מולקולריים. תוצאות זה שיישוני צעד ריכוז בגורם ריכוז כולל של> 10 5 לכל וירוס שהיה נוכח במים נבדקות.
מגבלה שלישית היא נוכחותם של מעכבי הליכים מולקולריים בדגימות סביבתיות. למרות מספר רב של גישות להסרת מעכבים פותחו, אין גישה יעילה לכל מטריצות המים וסוגי וירוס 6,34,35, מה שהופך את השימוש בבקרות פנימיות שנועדו להעריך את הרמה של עיכוב חיוני. מגיב G הצהבת בשימוש בשיטה זו עונה על דרישה זו על ידי מתן על רמה קבועה של רנ"א הנגיפי בכל התגובות וassay RT-qPCR להערכת עיכוב. כאשר הטוב ביותר של tהוא מעכב גישות ההסרה להיכשל כדי להסיר עיכוב, יכולים להיות מדוללים תרכיזי מדגם עוד ריכוזי וירוס הם גבוהים מריכוזי מעכב 14,15.
יש ההליך העקום הסטנדרטי המתואר במסמך זה גם יתרונות ומגבלה עיקרית. יתרון הוא שמגיב משמש אספקה כל המרכיבים הדרושים במגיב אחד, המאפשר שליטה יחידה שתשמש לכל מבחני. מגיב הדבר נכון במיוחד יתרון עבור מבחני norovirus. ניתן להשיג חלקיקי norovirus רק מאנשים נגועים ולכן קשה מאוד להשיג חלקיקים נגיפיים לשימוש כסטנדרטים. יתרון חשוב נוסף הוא שהיא מספקת סטנדרטית RNA לכל וירוסי RNA הממוקדים במגיבה אחד, כבעל סטנדרטי RNA הוא חיוני לכימות מדויק של RNA 36. עם זאת, יכולתו לכמת במדויק וירוס היא מוגבלת על ידי העובדה שהשפעות המטריצה אינן נלקחות בחשבון. משמעות הדבר היא כי עותק הגנומיערכי מספר אינו יכולים להיחשב מוחלטים וצריכים להיחשב רק במונחים יחסי. מומלץ מספר מספיק של מניות aliquots עובדות עקומה סטנדרטית (שלב 1.2) להיות מוכן לכיסוי לימודים מלאים. לדוגמא, כל aliquot μl 250 מספק מגיב מספיק ל6 צלחות RT. אם ידוע שמחקר דורש ניתוח של 500 דגימות, מינימום של 12 aliquots יהיה צורך (500 דגימות / 7 דגימות לכל צלחת RT / 6 צלחות RT לaliquot).
EPA שיטה 1,615 היא שיטה מבוססת ביצועים. יצרנים רבים להפוך ריאגנטים שווי ערך לאלה המפורטים ובניתן להחליף ריאגנטים אלה כל עוד קריטריוני ביצועים הם נפגשו. העקומה סטנדרטית, המשמשת גם כביקורת חיובית RT-qPCR, היא בעל ערך בבעיות ביצועים לפתרון בעיות. ביצועים יכולים לרדת עקב הידרדרות של רנ"א, חיי מדף מגיב, כישלון של מקפיאים, כיול מכשיר, וטעות טכנית. בעיות ביצועים צריכים להיות חשודותאד אם עקומות סטנדרטי שונה שממוצגים באיור 4 או אם הם אינם עומדים במפרט ביצועים לעקומות סטנדרטיים. Assay RT-qPCR הוא די חזק; כישלון מוחלט הוא כנראה עקב טיפול לא נכון של RNA או טעות טכנית (למשל, מגיב חסר). בזהירות רבה יש לנקוט בטיפול בדגימות RNA בין החילוץ וצעד RT להפחית השפלה RNA מribonucleases.
החלמה מנגיף פוליו המים קרקע וכיתה מגיב והחלמת norovirus עכברית מתהום פגשה EPA שיטת 1,615 קריטריונים לקבלת ביצועים (לוח 11) ודומים לאלה שדווחו על ידי אחרים 33,37,38. ההחלמה norovirus Murine מדגימות LFB היו נמוכה בהרבה מאלו של נגיף הפוליו ולא עמדה בקריטריוני קבלת נגיף הפוליו ספציפי. הסיבות להתאוששות norovirus עכברית נמוכה ממי כיתה מגיב אינן ידועות. collea דומה לתוצאות במסמך זה, כרים וגואז דיווח התאוששות לGI.1 norovirus של 4% ממים ברז 39. לי ואח '. 37 דיווחו החלמה ממוצעת לnorovirus עכברי וGII.4 norovirus האנושי של 18% ו -26% ממים מזוקקים באמצעות מסנני דיסק, בהתאמה. שימוש בתנאים דומים ללי ועמיתים, קים וKo נצפו החלמה של 46% ו -43% לוירוסים אלה, בהתאמה 38. גיבונס et al. 40 הושג סביב התאוששות 100% מGII.4 norovirus האנושי ממי ים, אבל קים וKo 38 מצאו כי התוספת של מלח למים מזוקקים בריכוזים דומים או גבוהים יותר מאשר מי ים באופן משמעותי החלמה מופחתת של הווירוס עכברי והביאה לירידה כפולה בהתאוששות GII.4.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |