Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.
EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.
定量PCR(qPCR的;参见在此手稿中使用的术语的定义的补充材料)和逆转录的qPCR(RT-qPCR的)可用于检测和定量在环境人类肠道病毒和饮用水水域有价值的工具,尤其是对许多病毒做不能复制或在细胞培养系统中复制较差。这两种工具已经表明,许多病毒类型中存在的环境和饮用水在全世界1-6。在其使用期间的疾病爆发调查加上扩增的基因组片段的测序提供了证据水性病毒传输,因为它们已经表明,在饮用水中发现的病毒是相同的梭口由暴发患者7-10。
两者的qPCR和RT-qPCR的是有用的公共卫生工具。例如,由美国环境保护署(EPA)进行的研究数据显示,牢固的关系是吐温指标的测量通过qPCR和娱乐用水健康的影响。其结果是,美国环保署的最后2012娱乐水质标准包括定量PCR方法监测休闲海滩11,12。博查特和他的同事还发现,在使用未经处理的地下水和病毒地下水社区急性胃肠炎之间有很强的关系,通过RT-qPCR的1计量。
本文的目的是描述的EPA方法1615 13,14分子检测组件。该检测使用RT-qPCR的通过正电滤色片提供肠病毒和每根据通过环境或饮用水的原体积升诺罗病毒基因组拷贝(GC)的一个定量估计。分子过程的概述示于图1。议定书部分1的详细信息的步骤制备标准曲线。这些标准是由一个包含RN试剂准备靶序列的所有的引物/探针组的副本。第2节描述的第三浓度的过程。部分3给出了从浓缩水和对照样品中提取的RNA的过程。每个测试样品的RNA是使用一式三份检测和随机引物素转录(第4)反转录。从各逆转录反应中的cDNA被分成五个分离的病毒特异性测定法所通过qPCR一式三份进行分析(第5部分; 图2)。该测定法使用引物和探针从科学文献(表1)被设计为检测许多肠病毒和诺如病毒和含有庚型肝炎的RNA,以确定测试样品是抑制至RT-qPCR的15的试剂。
源和饮用水水体病毒污染的国家大型研究需要使用多个分析实验室。在这些条件下,需要一个标准方法,以确保由多个实验室产生的数据是具有可比性。有许多已发表的分子生物学方法进行病毒检测,但很少有标准化的分子生物学方法。 EPA方法1615专门用于检测肠道病毒和诺如病毒的水基体,通过RT-qPCR的设计了一个标准化的方法。标准化的分子的方法可用于病毒检测在食品(CEN / ISO TS 15216-1和CEN / ISO TS 15216-2; 4月7,2013年)16,17和已应用于肝炎的检测病毒和诺沃克病毒在弹簧水16。所有的标准方法必须包括质量性能的控制和标准,以尽量减少内部和实验室变异,由于实验室污染误报数据。为了进一步减少虚假数据,EPA方法1615以下环保局的指导分子方法,18时的处理和单向工作流程规定的工作分开。它包括一个庚型肝炎1,19的内部控制和程序,以最小化由于RT-qPCR的15的抑制剂假阴性结果。它使用定量检测连同两者水取样,水分析,以使所有字段信息中的表示每升场或饮用水采样基因组拷贝的标准化体积。虽然高效的单管(一步)的RT-PCR测定法是市售的,所述方法有意使用单独的测定。这具有最小化的样品,可以在每个反应进行测定的量的缺点,但给出了使用多个引物组更大的灵活性。 RT-qPCR实验是由只有不如引物和探针使用,可能没有引物组将检测组中的所有病毒变种的限制。肠道病毒引物的选择,因为它的目标的保守5'-非编码区,20,21检测多种肠病毒血清型,和通过将其检测到的病毒与来自未处理的地下水1的消耗量的健康影响相关联。两套引物用于检测基因型组的诺如病毒我22,23。第一个被选为由于幼儿健康影响之间的强相关性,并检测到的病毒1。第二个基因型组I组引物和用于基因型组II诺如病毒引物对被选中,是因为他们发现最广泛株24,25。
尽管中的qPCR和RT-qPCR的程序在水中检测病毒RNA的主要优点外,还有一些限制。首先,无论感染性和非感染性的病毒颗粒,包括由消毒剂失活,可以通过这些程序扩增。博尔夏特的结果表明,这是一个问题较少未处理地下水˚FROM含水层类似于那些在社区学习比消毒地表水1。对于培养的病毒这个问题可以用PCR结合文化26,27加以克服。该问题还通过使用核酸交联剂28-30中讨论某些病毒。这后一种方法是更有效的病毒通过次氯酸盐灭活和不能有效地那些通过UV灭活。
这些分子的程序的第二个限制是,浓缩的样品的体积是通常可以测定是比用于培养程序6,31小得多。这个问题通常是由任一对由有机絮凝标准次级浓度,这允许样品被重新悬浮在更小的体积,或通过加入叔样品浓度步骤6,32,33的代以聚乙二醇为基础的程序处理。方法1615使用centrifugal超滤提供三级浓度。离心超滤除去水和组件小于30,000道尔顿造成任何病毒的测试样品中的浓度和在分子检测的小分子量抑制剂的降低。此第三浓度步骤的结果在> 10 5的总浓度因子为任何病毒,这是存在于水中的被测试。
第三个限制是环境样品中分子程序抑制剂的存在。尽管众多的方法来除去抑制剂已经被开发出来,没有办法是有效的所有水矩阵和病毒类型6,34,35,使得利用设计来估计抑制必需的水平的内部控制。在此方法中使用的庚型肝炎试剂通过提供病毒RNA的恒定水平在所有的反应和用于估计抑制一个RT-qPCR分析满足这一要求。当最好的t他除去抑制剂的方法无法除去抑制,样品浓缩物可以,只要病毒浓度比抑制剂浓度14,15更高稀释。
这里所描述的标准曲线方法既有优点也有一个主要的限制。一个优点是,该试剂耗材使用所有必要的组件在一个单一的试剂,从而允许使用用于所有检测的单一控制。该试剂是尤其对于诺罗病毒测定的优点。诺罗病毒颗粒仅能从感染个体使它很难获得病毒颗粒,用作标准获得。一个更重要的优点是,它提供了所有目标RNA病毒的RNA标准在一种试剂,作为具有的RNA标准是用于RNA 36的准确的定量是必不可少的。然而,它的准确量化病毒能力是由基体效应不考虑这一事实的限制。这意味着,基因组拷贝号值不能被认为是绝对的,只应在相对术语加以考虑。所以建议的标准曲线工作原液等分足够数目(步骤1.2)来制备以覆盖完整的研究。例如,每250微升等分试样提供足够的试剂为6 RT板。如果已知一个研究需要500个样品的分析,至少12等份,将需要(500个样品每RT板/ 7个样品/每等分6 RT平板)。
EPA方法1615是一种基于业绩的方法。许多制造商作出等效试剂与本文指定,这些试剂可以只要性能标准得到满足被取代。标准曲线,其也用作正的RT-qPCR的控制,是在解决性能问题值。性能可以拒绝由于降解RNA的试剂保质期,冷藏箱出现故障,仪器校准和技术性错误。性能问题应该是犯罪嫌疑人编如果标准曲线从图 4中所示的不同,或者如果它们不符合标准曲线的性能规格。在RT-qPCR分析是相当稳健;彻底失败可能是由于操作不当RNA或技术错误 (例如,缺少试剂)。大应小心处理提取和RT步骤,以减少RNA降解的核糖核酸酶的RNA样品。
脊髓灰质炎病毒回收率从地面和试剂级水和鼠诺如病毒回收率为地下水满足EPA方法1615性能验收标准 (表11),并有类似报道他人33,37,38。鼠诺如病毒回收率LFB样品均高于脊髓灰质炎病毒的要低得多,不会遇到脊髓灰质炎病毒的具体验收标准。其原因来自试剂级水低鼠诺如病毒的恢复是未知的。类似的结果在此,卡里姆和collea客串报告恢复为4%,从自来水39诺罗病毒GI.1。 Lee等37报道平均回收率为鼠诺罗病毒和18%的人的诺罗病毒GII.4和从蒸馏水用盘式过滤器,分别为26%。使用相似的条件,以利和他的同事,金和Ko观察回收率为46%和43%的这些病毒, 分别为38。 Gibbons等40绕从海水人类诺罗病毒GII.4的100%的回收率获得,但金和Ko 38发现,加入盐,以蒸馏水的浓度相似或比海水更高鼠病毒显著减少回收率并导致在大约一个两倍减少GII.4恢复。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
1.5 mL tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-3000 | |
1°C cool brick | Diversified Biotech | BRIK-2501 | |
10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130 | |
-20 °C freezer | VWR | 97043-346 | Must be a manual defrost freezer |
-70 °C or colder freezer | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
96-well chamber | Diversified Biotech | CHAM-1000 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Armored RNA EPA-1615 | Asuragen | Custom order | Used for quantifying the RT-qPCR assay |
Armored RNA Hepatitis G virus | Asuragen | 42024 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
Biosafety cabinet | NuAir Laboratory Equipment Supply | Labgard 437 ES | |
Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10856 | Crystalline grade or better |
Buffer AVE | Qiagen | 1026956 | Carrier RNA dilution buffer |
Buffer AVL | Qiagen | 19073 | Extraction buffer |
Carrier RNA | Qiagen | Not applicable | Use carrier RNA supplied with Buffer AVL |
Centrifuge bottles | Fisher Scientific | 05-562-23 or 05-562-26 | |
Centrifuge rotors | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
Dithiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
LightCycler® 480 Probes Master kit | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps |
Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
Microseal 'A' film | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat resistant |
Microseal 'F' film | Bio-Rad Laboratories | MSA1001 | Freezer resistant |
Mini-plate spinner | Labnet International | MPS1000 | |
Multichannel pipette | Rainin | L8-20 | |
Multi-tube chamber | Diversified Biotech | CHAM-5000 | |
Optical reaction plate | Life Technologies | 4314320 | |
PCR nucleotide mix | Promega | U1515 | |
PCR plate | Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | |
PCR-grade water | Roche | 3315932001 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
Plate mixer | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
Prionex gelatin | Sigma Aldrich | G0411 | |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit |
Quantitative PCR thermal cycler | Life Technologies | 4351405 | |
Random primer | Promega | C1181 | |
Reagent Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | 367501 | |
RNase Inhibitor | Promega | N2515 or N2615 | |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223 | |
SuperScript II or III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 or 18080044 | |
Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
Thermal cycler | Life Technologies | 4314879 | |
Trisma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Vivaspin 20 centrifugal concentrator units | Sartorius-Stedim | VS2022 |