Мы опишем протокол для мониторинга динамики Ca 2+ в аксонов фоторецепторов колбочек, используя препарат ломтик экс-естественных условиях сетчатки мыши. Этот протокол позволяет комплексные исследования конус Са 2+ сигналов в качестве важного млекопитающих модельной системы, мышь.
Фоторецепторов сетчатки конуса (конусов) служат дневного видения и основу цвета дискриминации. Они подвергаются дегенерации, часто приводит к слепоте во многих заболеваний сетчатки. Кальций (Са 2+), ключевой вторичный мессенджер в передаче сигналов фоторецепторов и метаболизма, было предложено быть косвенно связаны с дегенерацией фоторецепторов в различных моделях на животных. Систематически изучая эти аспекты конуса физиологии и патофизиологии была затруднена из-за трудности электрически записи с этих маленьких клеток, в частности, в мыши, где сетчатка доминируют стержневых фоторецепторов. Чтобы обойти эту проблему, мы установили Ca 2+ протокол изображения двухфотонный помощью мыши трансгенной линии, которая выражает генетически закодированного Са 2+ биосенсора TN-XL исключительно в конусах и может быть гибридных моделей с мыши для дегенерации фоторецептора. Протокол, описанный здесь, включает подготовку вертикальных секций (R20; ломтики ") на сетчатке мышей и оптических изображений легких стимулирования, вызвали изменения в конус Са 2+ уровня. Протокол также позволяет "в-ломтик измерения" абсолютных концентраций Са 2+; как запись может следовать калибровки. Этот протокол позволяет исследования в функциональных свойствах конуса и, как ожидается, внести свой вклад в понимание конуса Са 2+ сигналов, а также потенциального участия Са 2+ в фоторецепторов смерти и дегенерации сетчатки.
Видение начинается с активации светло-индуцированной фототрансдукции каскада в фоторецепторов сетчатки. Род фоторецепторы позволяют зрение на низких уровнях освещенности, в то время как конус фоторецепторов посредником цвета и высоким разрешением дневного видения. Многие фоторецепторов-специфических генов подвержены мутации, которые приводят к дегенерации этих клеток. Количество молекулярных маркеров, связанных с потерей фоторецепторов были идентифицированы 1, но до сих пор подробные молекулярные механизмы и последовательность событий, остаются неясными. Измененные Са 2+ гомеостаз предположил, чтобы быть триггером фоторецепторов гибели клеток, гипотеза поддерживается регуляцию активности Са 2+ -зависимых протеаз калпаина типа в процессе дегенерации 2,3. Тем не менее, на сегодняшний день, эта гипотеза не подкреплены физиологических измерений Ca 2+. Несоответствия в нескольких исследованиях о влиянии Ca 2+ антагонистов в рекишечные заболевания более осложняется участие Са 2+ в гибели клеток 4-6, призывая методов оценки непосредственно Са 2+ в млекопитающих фоторецепторов колбочек.
Ранее большинство электрических записи и исследования изображений Ca 2+ были проведены в амфибий и рептилий моделей из-за легкого доступа к конусов 7-9. Тем не менее, млекопитающих фоторецепторов физиология может отличаться от не-млекопитающих 10 и особенно в контексте человеческого наследственного дегенерации сетчатки, лучшее понимание млекопитающих фоторецепторов физиологии ключом к развитию инновационных методов лечения. Многие модели мыши, имитирующие заболеваний сетчатки человека имеются, но мало известно о Ca 2+ динамики в конусах мыши 11. Электрические методы не подходят для высокой пропускной записей из конусов, в частности, не у мышей, где прутки (~ 97%) значительно больше, чем конусы (~ 3%) 12 </sдо>. Кроме того, чувствительные электрофизиологические методы, такие как цельноклеточных записей патч-зажим беспокоить внутриклеточный среду и предоставить данные о Са 2+ токов, но не на абсолютных внутриклеточной концентрации Са 2+. Следовательно, несмотря на более низкую временным разрешением, изображения является методом выбора при решении вопросов о конусных Са 2+ динамики. Ключевой вопрос с изображениями, как выборочно пометить конусы с флуоресцентным Ca 2+ индикатор красителя. Правильное компартментализация и сотовый специфика трудно достичь, "основная загрузка" синтетический Са 2+ индикатор красителей в тканях. Как следствие, помеченных конусов, стержней 13,14 и Müller глиальные клетки не могут быть надежно отличается. Кроме того, синтетические красители, как правило, утечка из клеток, предотвращая длительные записи в соответствии условий. Кроме того, синтетические загрузки Ca 2+ показатели по своей форме АМ-эфира является проблематичным, поскольку он требует деtergents (например, ДМСО) и генерирует формальдегид 15. Для абсолютных измерений Са 2 +, логометрических показатели являются обязательными. Тем не менее, лучшими в настоящее время синтетические пропорциональный показатель Fura-2 требуется возбуждающего света в диапазоне от 700 до 760 нм (для двухфотонном возбуждении), который, в зависимости от его интенсивности, могут сами по себе стимулировать конусы, и, таким образом, препятствовать исследования конус Са 2+ динамика в физиологических условиях освещения.
В отличие от синтетических красителей, генетически закодированные Са 2+ показатели могут быть выражены в типа селективного образом клеток. Они не вытекать из клеток, и, следовательно, если избегать отбеливание, длительные и надежные измерения логометрических возможны. Типа селективный сотовый выражение Ca 2+ биосенсоров, в сочетании с двумя-фотонной микроскопии, представляет собой мощный инструмент для оценки и изучения внутриклеточной Са 2+ под значительной степени физиологических условиях 13,16,17 </SUP>. Здесь мы опишем протокол для изучения световой раздражитель вызывал-конус Са 2+ динамика в трансгенных Ca 2+ биосенсора мыши линии (HR2.1: TN-XL), которая выражает лада на основе Ca 2+ биосенсора TN-XL 18 выборочно в конусах, в человеческом красный опсина промоутер HR2.1 19. Чтобы получить доступ к конусные клеммы, был использован препарат экс-естественных ломтик 20. Протокол был уже успешно используется в трех исследованиях на функции конуса у здоровых мышей 10,21,22. Кроме того, протокол позволяет изучать конуса Са 2+ сигналов в конкретных генетических заболеваний, например, путем скрещивания модели мыши для наследственной дегенерации сетчатки с HR2.1: мышей ТН-XL.
Предварительно существующие протоколы, использующие электрофизиологические записи одноклеточных или Ca 2+ изображений с синтетическими люминесцентных индикаторов бороться, чтобы записать Ca 2+ динамику мыши конуса фоторецепторов по ряду технических причин (см введение). Протокол, описанный здесь, позволяет измерять Са 2 + сигналов и даже абсолютных Са 2+ уровня в отдельных, определенных мыши конуса терминалов в эффективной и относительно простой способ.
Этот протокол уже успешно используется в трех исследованиях, касающихся различных аспектов функции конуса в сетчатке здорового мыши. В первом исследовании 10, HR2.1: мышь TN-XL характеризуется использованием иммуногистохимии, ERG записи, двухфотонную Ca 2+ изображений и фармакологию, показывая, что конус-специфическая экспрессия Са 2+ биосенсора не мешает конус анатомия и функция. Во втором исследовании 21, хроматическаяи ахроматические свойства отклика мыши конусов были намечены по сетчатке, демонстрируя поразительные различия в функции конуса между «зеленой» опсина доминируют спинного и "голубой" опсина доминируют вентральной части сетчатки мыши. Эти региональные различия в свойствах конуса соответствует распределение дифференциального контраста в естественной среде (т.е., небо против земли), предполагая, что различные спектральные типы мыши конусов обеспечивают (ближайшем) оптимальной выборки ахроматических контрастов и, таким образом, может предложить эволюционное преимущество. В третьем исследовании 22 обратной обратной связи, который конуса аксонов получают от горизонтальных клеток исследовали. Как и все предлагаемые механизмы обратной связи по горизонтали ячейки действуют на напряжения закрытого Ca 2+ каналов в конусе аксонов 28, конус терминал Са 2+ может служить в качестве прокси для горизонтальных клеток в конусе взаимодействий. Исследование Kemmler и сотрудники 22 опорымнение, что горизонтальные клетки используют сложную систему обратной связи, содержащую несколько механизмов для управления фоторецепторов выпуск глутамата.
Эти исследования показывают универсальность описанного протокола и показать, что она может быть приспособлена к широкому диапазону вопросов относительно функции конус и синаптические цепи. Кроме того, протокол дает возможность изучать местное Ca 2+ сигналов в разных отсеках конуса, в направлении лучшего понимания конуса физиологии. Такое знание важно понять патофизиологические процессы в вырождающихся конусов, в конечном счете, позволит рационального развития потенциальных терапевтических подходов, в частности, для дегенеративных заболеваний, влияющих на конусы.
В HR2.1: TN-XL мыши линии, Ca 2+ биосенсора экспрессируется по всей конуса, за исключением наружного сегмента. Это дает возможность для прямого и логометрической оценки Са 2+ динамическийс отделениями в разных конуса. С изменениями в Са 2+ токи в наружном сегменте отражаются в терминалах через мембранный потенциал и в результате активации напряжения закрытого Са 2+ каналов, процессы в космическом сегменте можно наблюдать косвенно.
Потенциальные ловушки:
Рассечение сетчатки является важным шагом: В мыши, сетчатка отделяется от окуляра, как правило, между наружных сегментов фоторецепторов и пигментного эпителия. Таким образом, светочувствительный наружных сегментов фоторецепторов изолированной сетчатки подвергаются и чрезвычайно чувствительны к механическим повреждениям. Большое внимание должно быть принято, чтобы не повредить, касаясь фоторецепторов сторону с инструментами или путем перемещения ткани боком на клейкой поверхности (например, мембрану фильтра).
Высококачественные сетчатки ломтики могут быть признаны под микроскопом их чистой режущей поверхности ис помощью хорошо организованной фоторецепторов слоя с четко определенными наружных сегментов. Функциональная оценка качества среза может быть сделано быстро мигающий яркий свет стимулы и определения процентного отзывчивых конусов (например, в поле зрения с 10 – 20 конусов). Здесь, качество реакция должна быть оценена путем расчета отношения сигнал-шум (S / N) (амплитуда базового шума до световой раздражитель против амплитуды световой ответ); S / N 2 – 3 следует рассматривать как минимальный порог. Как правило, отбросить кусочки с менее чем 50%, реагирующих конусов. Также ломтики с шишками, которые отображают чрезмерное поведение спонтанной пики (рис 4 в 10) следует выбросить.
Ломтики в записи камеры, которые отвечают вышеупомянутым анатомические и функциональные критерии показывают последовательные ответы в течение 1 – 2 ч (для подробной информации о последовательности реакции, см 10). Потому что ломтики выжить чНаши в удерживающей камере, успешный эксперимент может длиться до 6 часов. Стоит отметить, что существуют некоторые ограничения в отношении к изучению давно, начиная пространственных взаимодействий между конусами и горизонтальными клетками, а нарезка неизбежно разрывает боковые связи в сетчатке глаза сетей. Тем не менее, увеличение толщины сетчатки ломтиками до 300 мкм улучшает эту проблему 22.
Использование вертикальных срезов сетчатки позволяет избежать сканирования светочувствительным конуса наружных сегментов с помощью лазера возбуждения и, таким образом, в значительной степени предотвращает обесцвечивание Opsin (для широкого обсуждения см 10,21). Тем не менее, записанные Са 2+ сигналов зависит не только от световых сигналов, но также получить затронуты фоновой подсветкой компонента, генерируемого лазером возбуждения сканирования. В самом деле, эффективна подсветка в таких двухфотонных экспериментов изображений представляет собой сочетание рассеянного лазерного света, флуоресцентного света, испускаемого записанного CEзаполняет, и любой индикатор стимулом фон компонента. Таким образом, конусы должны иметь возможность адаптировать по крайней мере 20 – 30 с до лазерного сканирования (с фоновой составляющей светового раздражителя включен) перед записью.
Преимущества и применение:
В то время как некоторые приложения для этого конуса Са 2+ -imaging протокола были описаны выше 10,21,22, другие приложения могут быть предусмотрены: Фармакологические исследования в сочетании с конусом Са 2+ изображений может подтвердить Ca 2+ сигнальных путей в конусах и может быть используется для проверки эффективности и потенции наркотиков, предназначенных для различных игроков в Ca 2+ -signaling 10. Тем не менее, ключевым приложение может быть для изучения заболеваний, влияющих на функцию конуса. Многие модели сетчатки дегенерация мыши, имитирующие человеческие болезни имеются. Например, потеря колбочек 1 (CPFL 1) мышь первичной дегенерации конус модель страданиеот мутации Pde6c 29. С другой стороны, стержень дегенерации 1 (ий 1) мыши страдает от мутации Pde6b. В то время как это вызывает основной стержень дегенерацию фоторецепторов 30 раз го 1 поражение стержень завершены, вторичные наборы конус вырождение 1. Скрещивание этих животных с HR2.1: TN-XL линия позволит изучения и сравнения Ca 2+ динамику первичной и вторичной дегенерации конуса и, вероятно, получить ценную информацию о роли Са 2+ во конус гибели клеток. Кроме того, фармакологически индуцированной конуса дегенерации – например, с использованием селективных ингибиторов PDE6 – может служить для идентификации вниз по течению механизмы конус вырождения 10,29,31.
Таким образом, протокол, описанный здесь, позволяет измерять Ca 2+ в субклеточных отсеков мыши конуса фоторецепторов и представляет большие возможности для выявления конуса физиологию в широком диапазонефизиологических и патофизиологических условиях. Кроме того, этот протокол может быть использован для скрининга фармакологических агентов, предназначенных для мешать конус Са 2+ -signaling и тем самым помочь в создании новых методов лечения для конусных заболеваний.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |