Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.
Cones fotorreceptores da retina (cones) servir visão luz do dia e são a base da discriminação de cor. Estão sujeitos a degeneração, conduzindo muitas vezes a cegueira em muitas doenças da retina. O cálcio (Ca 2+), de um segundo mensageiro chave na sinalização de fotorreceptores e metabolismo, tem sido proposto para ser indirectamente ligada com a degeneração de fotorreceptores em vários modelos animais. Estudar sistematicamente estes aspectos de fisiologia e patofisiologia cone tem sido dificultada pelas dificuldades de gravação electricamente a partir destas pequenas células, em particular no rato onde a retina é dominada por bastonetes. Para contornar este problema, foi estabelecido um protocolo de imagem de dois fótons Ca 2+ usando uma linha de rato transgénico que expressa o codificado geneticamente Ca 2+ biossensor TN-XL exclusivamente em cones e podem ser cruzados com modelos de ratos para degeneração de fotorreceptores. O protocolo aqui descrito envolve a preparação de secções verticais (R20; fatias ") de retinas de ratos e imageamento óptico de luz muda evocadas por estímulo em cone Ca 2+ nível. O protocolo também permite que "medição in-slice" de concentrações absolutas de Ca2 +; como as gravações pode ser seguido por calibração. Este protocolo permite estudos em propriedades funcionais de cone e espera-se contribuir para a compreensão do cone de sinalização de Ca2 +, bem como o envolvimento potencial de Ca 2+ no fotorreceptor morte e degeneração da retina.
Visão começa com a activação induzida por luz da cascata de fototransdução em fotorreceptores retinais. Bastonetes permitir a visão em níveis baixos de luz, enquanto cones fotorreceptores mediar cor e alta resolução de visão luz do dia. Muitos genes específicos de fotorreceptoras são susceptíveis a mutações que conduzem à degeneração destas células. Um número de marcadores moleculares associados a perda de fotorreceptores foram identificadas 1, mas até agora os mecanismos moleculares detalhadas e a sequência de eventos permanecem obscuros. Altered homeostase de Ca2 + foi especulado para ser um gatilho de morte celular de fotorreceptores, uma hipótese suportada pela sobre-regulação da actividade de proteases dependentes de Ca2 + do tipo calpaina durante o processo de degeneração 2,3. No entanto, até à data, esta hipótese não é apoiada por medidas fisiológicas de Ca 2+. Inconsistências em diversos estudos sobre o efeito de bloqueadores dos canais de Ca 2+ em redoenças Tinal desafiou ainda mais o envolvimento dos Ca2 + na morte celular 4-6, pedindo métodos para avaliar directamente Ca2 + em cones fotorreceptores mamíferos.
Anteriormente, a maioria gravação elétrica e estudos de imagem Ca 2+ foram realizados em modelos de anfíbios e répteis por causa do acesso mais fácil aos cones 7-9. No entanto, a fisiologia dos mamíferos de fotorreceptores pode ser diferente do que a do não-mamíferos e, especialmente, 10, no contexto de degeneração retinal hereditária humana, uma melhor compreensão da fisiologia de mamíferos fotorreceptores é uma chave para o desenvolvimento de tratamentos inovadores. Muitos modelos de ratos que imitam doenças da retina humanos estão disponíveis, mas pouco se sabe sobre a dinâmica de Ca2 + em cones de rato 11. Técnicas eléctricas não são adequados para gravações de alto rendimento a partir de cones, em particular, não em ratinhos, em que as hastes (~ 97%) significativamente mais numerosos cones (~ 3%) 12 </sup>. Além disso, técnicas electrofisiológicas sensíveis, tais como gravações de células inteiras de patch-clamp perturbar o meio intracelular e fornecer dados sobre as correntes de Ca2 + mas não em concentrações intracelulares de Ca2 + absolutos. Assim, apesar da resolução temporal inferior, imagem latente é o método de escolha no tratamento de questões sobre cone Ca 2+ dinâmica. A questão-chave com imagens é como rotular selectivamente os cones com um corante indicador fluorescente Ca 2+. Compartimentalização adequada e especificidade celular é difícil de alcançar por "a granel-loading" sintética Ca 2+ corantes indicadores no tecido. Como conseqüência, cones rotulados, hastes 13,14, e células gliais de Müller não pode ser confiavelmente distinguidos. Além disso, os corantes sintéticos tendem a vazar para fora das células, impedindo gravações prolongados em condições consistentes. Além disso, o carregamento sintéticos indicadores de Ca2 + na sua forma de éster AM é problemática, uma vez que requer detergents (por exemplo, DMSO) e gera formaldeído 15. Para absolutos Ca 2+ medidas, os indicadores raciométrica são obrigatórios. No entanto, o melhor indicador raciométrica sintéticos actualmente disponíveis Fura-2 requer a luz de excitação na gama de 700-760 nm (para a excitação de dois fotões), que, em função da sua intensidade, pode, por si só estimular os cones, e, assim, impedir de estudos cone de Ca 2+ funcionamento sob condições de iluminação fisiológicas.
Ao contrário dos corantes sintéticos, geneticamente codificados indicadores de Ca2 + pode ser expressa de uma maneira selectiva de células-tipo. Eles não escapam para fora das células, e, por conseguinte, se o branqueamento é evitada, medições raciométrica prolongados e fiáveis são possíveis. Tipo seletivo celular expressão de Ca2 + biossensores, quando combinado com a microscopia de dois fótons, representa uma poderosa ferramenta para avaliar e estudar subcelular Ca 2+ em condições fisiológicas, em grande parte 13,16,17 </sup>. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a luz evocada pelo estímulo cone Ca 2+ dinâmica em um transgênico Ca 2+ linha biossensor rato (HR2.1: TN-XL), que expressa a baseada em FRET Ca2 + biossensor TN-XL 18 seletivamente em cones, sob a opsina humano vermelho promotor HR2.1 19. Para acessar os terminais de cone, uma preparação fatia ex-vivo 20 foi empregado. O protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos sobre a função cone em ratos saudáveis 10,21,22. Além disso, o protocolo permite estudar cone de sinalização de Ca2 + em condições genéticas específicas, por exemplo, cruzando modelos de ratos para a degeneração da retina hereditária com HR2.1: ratos TN-XL.
Protocolos pré-existentes usando gravações unicelulares eletrofisiológicos ou Ca 2+ imagem com indicadores sintéticos fluorescentes lutam para gravar as Ca2 + dinâmica no rato cones fotorreceptores para um número de razões técnicas (ver Introdução). O protocolo aqui descrito permite a medição de sinais de Ca2 + e até absolutos níveis de Ca 2+ em terminais, identificadas rato cone individuais de uma forma eficiente e relativamente simples.
Este protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos abordando diferentes aspectos da função cone na retina saudável mouse. No primeiro estudo 10, o HR2.1: rato TN-XL foi caracterizado usando imuno-histoquímica, registos de ERG, dois fotões Ca 2+ de imagem, e farmacologia, que mostra que a expressão específica de cone do Ca 2+ biossensor não entrave cone anatomia e função. No segundo estudo, 21, cromáticoe propriedades de resposta acromáticas de cones de rato foram mapeados em toda a retina, demonstrando diferenças marcantes em função de cone entre a dorsal "verde" dominado pelos opsina eo "azul" ventral retina do rato-dominado opsina. Estas diferenças regionais nas propriedades cone combinando a distribuição do contraste diferencial no ambiente natural (isto é, contra o céu do solo), o que sugere que os diferentes tipos de cones espectrais do rato para proporcionar (próximo) de amostragem óptima de contrastes acromáticos e, assim, podem oferecer um vantagem evolutiva. No terceiro estudo 22 o feedback recíproco que os terminais de axónios cone receber a partir de células horizontais foi investigada. Como todos os mecanismos de feedback célula horizontal propostas agir em voltagem dependentes canais de Ca2 + nos terminais cone axônio 28, terminal de cone de Ca 2+ pode servir como um proxy em interações horizontais célula-cone. O estudo de Kemmler e colaboradores 22 apoiosa visão de que células horizontais utilizar um sistema de feedback complexo constituído por vários mecanismos para controlar a liberação de glutamato fotorreceptor.
Esses estudos ilustram a versatilidade do protocolo descrito e mostram que pode ser adaptada a uma vasta gama de questões relacionadas função dos cones e dos seus circuitos sinápticos. Além disso, o protocolo permite estudar locais de sinalização de Ca2 + nos diferentes compartimentos de cone, para uma melhor compreensão da fisiologia cone. Tal conhecimento é importante para compreender os processos fisiopatológicos em cones degeneração, para, eventualmente, permitir o desenvolvimento racional de potenciais abordagens terapêuticas, em especial para doenças degenerativas que afetam cones.
No HR2.1: linha rato TN-XL, o Ca 2+ biossensor é expressa ao longo do cone, com a excepção de o segmento exterior. Isso fornece uma oportunidade para avaliação direta e ratiometric de Ca 2+ dinâmicas em diferentes compartimentos do cone. Dado que alterações no Ca2 + correntes no segmento exterior são reflectidas em terminais via o potencial de membrana e a resultante activação de canais de Ca2 + dependentes da voltagem, os processos no segmento exterior pode ser observada indirectamente.
Armadilhas potenciais:
A dissecção da retina é uma etapa crítica: No rato, a retina se separa da ocular geralmente entre segmentos externos de fotorreceptores e epitélio pigmentado. Portanto, os fotorreceptores sensível à luz segmentos exteriores da retina isolada estão expostos e extremamente sensível a danos mecânicos. Grande cuidado deve ser tomado para não danificar tocando lado do fotorreceptor com ferramentas ou movendo o tecido de lado sobre uma superfície adesiva (por exemplo, uma membrana de filtro).
Fatias da retina de alta qualidade pode ser reconhecido sob o microscópio por sua superfície de corte limpo epor uma camada de fotorreceptores bem organizado, com segmentos externos claramente definidos. A avaliação funcional de qualidade fatia pode ser feita rapidamente através do escoamento estímulos luminosos brilhantes e determinando a percentagem de cones responsivos (por exemplo, em um campo de visão com 10 – 20 cones). Aqui, a qualidade da resposta deve ser avaliado por meio do cálculo da razão sinal-para-ruído (S / N) (amplitude do ruído de linha de base antes do estímulo de luz versus amplitude da resposta de luz); A S / N de 2-3 deve ser considerado como o limite mínimo. Normalmente, descartamos fatias com menos de 50% cones responsivos. Também corta com cones que exibem comportamento spiking espontânea excessiva (ver Figura 4 em 10) deve ser descartada.
Fatias na câmara de gravação que atendem aos critérios anatômicos e funcionais acima mencionados apresentam respostas consistentes para 1-2 hr (para obter detalhes sobre a consistência de resposta, consulte 10). Porque fatias sobreviver por hnosso na câmara de retenção, uma experiência bem sucedida pode durar até 6 horas. Vale ressaltar que existem algumas restrições no que diz respeito ao estudo de longo-variando interações espaciais entre cones e células horizontais, como cortar inevitavelmente rompe conexões laterais em redes de retina. No entanto, o aumento da espessura das fatias da retina a 300 um melhora esta questão 22.
O uso de fatias verticais da retina evita a sintonização dos segmentos exteriores do cone sensível à luz por o laser de excitação e, assim, em grande parte, evita branqueamento opsina (para discussão extensa, ver 10,21). No entanto, os sinais gravados de Ca2 + não só dependem dos estímulos de luz, mas também ficar afectado por um componente de iluminação de fundo gerado pelo laser de excitação digitalização. Na verdade, a iluminação de fundo eficaz em tais experiências de imagiologia de dois fótons é uma combinação de luz laser dispersa, de luz fluorescente emitida pelo ce gravadolls, e qualquer componente de fundo LED estímulo. Portanto, cones devem ser autorizados a se adaptar por pelo menos 20 – 30 s para varrimento a laser (com o componente de fundo do estímulo de luz ligada) antes da gravação.
Vantagens e aplicações:
Enquanto algumas aplicações para este cone Ca 2+ protocolo -Imaging foram descritos acima 10,21,22, outras aplicações podem ser imaginado: estudos farmacológicos em combinação com cone de Ca 2+ de imagem pode validar Ca 2+ vias de sinalização em cones e poderia ser usado para testar a eficácia ea potência dos fármacos dirigidos a diferentes jogadores em Ca 2+ -signaling 10. No entanto, um aplicativo pode ser chave para estudar doenças que afetam a função cone. Muitos modelos da retina degeneração do rato que imitam doenças humanas estão disponíveis. Por exemplo, a perda de fotorreceptores cone 1 (CPFL 1) mouse é um cone principal modelo de degeneração sofrimentoa partir de uma mutação Pde6c 29. Por outro lado, a haste de rato degeneração 1 (rd 1) sofre uma mutação Pde6b. Enquanto isso faz com que haste principal degeneração de fotorreceptores 30, uma vez rd uma perda haste é concluída, conjuntos de cone degeneração secundária em 1. O cruzamento desses animais com o HR2.1: Linha TN-XL permitirá estudar e comparar Ca2 + dinâmica, tanto primária e secundária cone degeneração e é susceptível de proporcionar insights valiosos sobre o papel dos Ca2 + durante a morte celular cone. Além disso, farmacologicamente induzido degeneração cone – por exemplo, o uso de inibidores seletivos EFD6 – pode servir para identificar os mecanismos a jusante do cone degeneração 10,29,31.
Em resumo, o protocolo descrito aqui permite medir Ca 2+ em compartimentos subcelulares de fotorreceptores rato cone e apresenta grandes oportunidades para descobrir cone fisiologia sob uma ampla gamadas condições fisiológicas e fisiopatológicas. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o rastreio de agentes farmacológicos desenvolvidos para interferir com cone Ca 2+ -signaling e, assim, ajudar a estabelecer novas terapias para doenças cone.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |