The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
腸神経系(ENS)は、消化管1の壁内に埋め込 まれた2神経節のある叢で構成されています。これらの筋肉内の神経回路は、筋層間神経叢(MP)と粘膜下神経叢(SMP)は、ニューロンと腸溶性グリア( 図1)2で構成されている。 MPとSMPは、それぞれ、胃腸(GI)などの腸運動として機能し、上皮吸収および分泌、3を制御する。腸溶性グリアは神経節内のニューロンに近接して配置されているが、腸溶性グリアの集団はまた、繊維路と腸壁3,4の余分な神経節部分を相互接続内に存在する。腸グリアは、元々ニューロンにのみ栄養サポートを提供すると考えられていた。しかし、最近の研究では、強くENSは5,6機能するためのニューロングリア相互作用が必須であることを示唆している。例えば、データは、腸グリアは神経活動を7に「聴く」ことを示しているそして、神経回路6,8を変調する酸化ストレス9から腸ニューロンを保護し、損傷10,11に対応して新たな腸ニューロンを生成することができる。この技術審査で提示プロトコルは、その場の細胞内Ca 2+イメージングで使用してニューロンと腸溶性グリア間の複雑な相互作用を検討するためのシンプルかつ堅牢な方法を提供する。
Ca 2+が興奮性細胞に遍在シグナル伝達分子であり、神経系12におけるシナプスシグナル伝達事象において重要な役割を果たしている。ニューロンまたは腸溶性グリアの励起はどちら流入によってカルシウム2+透過チャネルまたはCaを通じて細胞内カルシウムストアから2+放出を細胞質Ca 2+濃度の上昇を誘発する。蛍光色素でニューロンおよびグリアにおけるイメージングのCa 2+トランジェントの機能的な組織とダイナミクスを研究するために設立され、広く使用される技術であるENS 13-17。のCa 2+イメージングは、ICCのペースメーカーネットワーク18および腸平滑筋19,20を通して興奮の広がりを解明するために、完全な消化管組織セグメントを研究する上で重要なツールであることが示されている。これは、生理的パラメータの広いスペクトルを調べるために、研究者を可能にし、それらの空間分布と時間的なダイナミクスの両方に関する情報を提供します。細胞は、効率的に膜透過性蛍光指示薬、最適化された染色プロトコル21を使用して、低侵襲性の方法で染色することができる。これは、生体内 23だけでなく、機能的に保存調剤14-16,22のニューロンの数が多く、腸溶性グリアを監視する機会を提供しています。組織標本をホールマウントバルクは、Ca 2+に結合した場合、その蛍光を増加するようのFluo-4などの高親和性のCa 2+指示薬色素がロードされている。蛍光の変化はCCDカメラおよびアナによって記録されるデジタルで6溶菌。 Ca 2+の出現は、ニューロンとグリア細胞の相互作用、様々な刺激に応答し、リアルタイムで消化プロセスにおけるこれらの細胞型の関与をモニターする機会を提供した。
その場でのCa 2+イメージングは、腸ニューロンとグリアのシグナル伝達機構に大きな洞察をもたらしたし、細胞培養モデル6,24に比べていくつかの明確な利点を有している。まず、 その場での製剤は、ニューロンとグリアのネイティブマトリックス環境を維持し、無傷組織を標的とするためにその接続の大部分を残す。第二に、遺伝学と培養された腸溶性グリアの形態は大きく、生体内 6,24と比較して変化している。第三に、多くのヘテロタイプの相互作用は、初代細胞培養中に失われ、この制限は、細胞 – 細胞相互作用を評価する。培養した細胞は、基本的な特性の調査、彼らのusefulneに適していますが、腸溶性グリアと神経細胞の間の複雑な相互作用を研究するためのssは限られている。シナプス経路は25そのまま残るように、その場でアプローチを使用して調査ニューロン-グリア相互作用は、より生理学的に関連ある。細胞培養のアプローチと比較すると、 その場でのアプローチで体系的にニューロンと腸溶性グリア間の複雑な相互作用を理解するための改善された条件を提供しています。さらに、全体のマウント製剤における神経節のある叢の平面組織は、細胞内Ca 2+トランジェントの蛍光イメージングのための理想的であり、この技術はENSのニューロン-グリア活性を評価するための直接的なアプローチを提供します。
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |