في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Summary

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca²⁺ imaging.

Abstract

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca²⁺) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca²⁺ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca²⁺ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca²⁺ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca²⁺ responses in enteric neurons and glial cells.

Introduction

وينظم الجهاز العصبي المعوي (ENS) إلى قسمين الضفائر عقدي جزءا لا يتجزأ من داخل جدار الجهاز الهضمي ^1. هذه الدوائر العصبية في العضل، الضفيرة العضلية المعوية (MP) والضفيرة تحت المخاطية (SMP)، وتتكون من الخلايا العصبية والدبقية المعوية (الشكل 1) ^(2). النائب وSMP تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظائف مثل حركية الأمعاء وامتصاص الظهارية وإفراز، على التوالي ^3. وتقع الدبقية المعوية على مقربة من الخلايا العصبية في العقد ولكن سكان الدبقية المعوية موجودة أيضا في ربط مساحات الألياف وأجزاء خارج العقدية من جدار الأمعاء ^3،4. ويعتقد الدبقية المعوية في الأصل لتقديم الدعم المغذي فقط إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، الدراسات الحديثة تشير بقوة إلى أن التفاعلات العصبية، الدبقية ضرورية لENS يعمل ^5،6. على سبيل المثال، تشير البيانات إلى أن الدبقية المعوية "الاستماع" إلى نشاط الخلايا العصبية ⁷وتعدل الدوائر العصبية ^6،8، وحماية الخلايا العصبية المعوية من الاكسدة ⁹ وتكون قادرة على توليد الخلايا العصبية المعوية جديدة استجابة للإصابة ^10،11. بروتوكول الواردة في هذا الاستعراض التقني يوفر طريقة بسيطة وقوية لدراسة تفاعل معقد بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية باستخدام في الموقع الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التصوير.

كاليفورنيا ²⁺ هو جزيء إشارة في كل مكان في الخلايا منفعل ويلعب دورا أساسيا في الأحداث يشير متشابك في الجهاز العصبي ^12. الإثارة من الخلايا العصبية أو الدبقية المعوية يتسبب إرتفاع في هيولي تركيز الكالسيوم ²⁺ إما عن طريق تدفق الكالسيوم من خلال قنوات ²⁺ -permeable أو الكالسيوم ²⁺ إطلاق سراح من مخازن الكالسيوم داخل الخلايا. التصوير كاليفورنيا ²⁺ العابرين في الخلايا العصبية والدبقية مع الأصباغ الفلورية وثابتة والتقنية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة التنظيم الوظيفي وديناميكيةفي ^13-17 ENS. وقد تبين التصوير كاليفورنيا ²⁺ أن تكون أداة هامة في دراسة سليمة شرائح الأنسجة GI لتوضيح انتشار استثارة من خلال شبكات تنظيم ضربات القلب المحكمة الجنائية الدولية ¹⁸ والأمعاء العضلات الملساء ^19،20. وهي تمكن الباحثين للتحقيق في طيف واسع من المعلمات الفسيولوجية ويقدم معلومات عن كل من توزيعها المكاني والزماني ديناميات. الخلايا يمكن أن تكون ملطخة بكفاءة بطريقة الغازية الحد الأدنى باستخدام مؤشرات الفلورسنت نفاذية الغشاء والبروتوكولات تلطيخ الأمثل ^21. هذا يتيح الفرصة لمراقبة عدد كبير من الخلايا العصبية والدبقية المعوية في الأعمال التحضيرية الحفاظ عليها وظيفيا ^14-16،22، وكذلك في الجسم الحي ^23. جبل كامل الاستعدادات الأنسجة هي الأكبر محملة عالية تقارب الكالسيوم ²⁺ مؤشر صبغ مثل فلوو-4 الذي يزيد مضان لها عندما بد أن الكالسيوم ^2+. يتم تسجيل التغيرات في مضان بواسطة كاميرا CCD وآناlyzed رقميا ^6. قدم ظهور الكالسيوم ²⁺ الفرصة لمراقبة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التفاعلات، والاستجابة لمختلف المحفزات، وإشراك أنواع الخلايا هذه في عمليات الجهاز الهضمي في الوقت الحقيقي.

في الموقع قد حقق التصوير الكالسيوم ²⁺ بصيرة آليات الإشارات من الخلايا العصبية المعوية والدبقية وتمتلك عدة مزايا واضحة على نماذج ثقافة الخلية ^6،24. أولا، في الموقع استعدادات المحافظة على البيئة مصفوفة الأم من الخلايا العصبية والدبقية وترك الجزء الأكبر من صلاتهم لاستهداف الأنسجة سليمة. وثانيا، فإن علم الوراثة ومورفولوجية الدبقية المعوية مثقف وبشكل ملحوظ مقارنة اختلف في الجسم الحي ^6،24. ثالثا، يتم فقدان كثير من التفاعلات غيروي في زراعة الخلايا الأولية وهذه حدود تقييم التفاعلات خلية خلية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة هي مناسبة تماما للتحقيق في الخصائص الأساسية، usefulne بهمSS لدراسة التفاعلات المعقدة بين الدبقية المعوية والخلايا العصبية محدودة. التحقيق تفاعل الخلايا العصبية، الدبقية باستخدام نهج في الموقع أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة كما تبقى مسارات متشابك سليمة ^25. بالمقارنة مع النهج ثقافة الخلية، وهو نهج الموقعي في تقدم وتحسن الظروف لفهم منهجي التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية. وعلاوة على ذلك، فإن المنظمة مستو من الضفيرة عقدي في الاستعدادات الكاملة جبل مثالية للتصوير الفلورسنت من الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ العابرين ويوفر هذا الأسلوب نهجا واضحة لتقييم نشاط الخلايا العصبية الدبقية في ENS.

Protocol

ملاحظة: الإجراءات التالية التي تنطوي على أنسجة من حيوانات المختبر تتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات عام 2013 وتمت الموافقة مسبقا من قبل جامعة ولاية ميشيغان IACUC. 1. إعداد الأنسجة تخدير الحيوان البحوث في غرفة تحتوي على 2.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين أو عن طريق وضع 3-5 مل من الأيزوفلورين السائل على مادة ماصة على أرضية الغرفة، وضمان أن حاجز مادي يمنع الحيوانات من الاتصال المباشر مع الأيزوفلورين. اختبار لمدى عمق التخدير بواسطة معسر قاطع الطريق. ملاحظة: ويعتبر عمق التخدير المناسب عندما لا يكون هناك رد فعل الانسحاب من أطرافهم هند. مرة واحدة تخدير مناسب، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وضع الحيوان في موقف ضعيف وتنظيف جلد البطن مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط لقرصة جلد البطن في خط الوسط واستخدام مقص جراحي لجعل وسائل الاعلام 6 سمل شق على طول الخط ألبا لفضح الجهاز الهضمي الداخلية. استخدام ملقط حادة لتحديد مكان وفضح الدقاق داخل الصفاق. قطع مساريق لفائفي / القولون مع مقص والبدء في كشف الأمعاء. بمجرد كشفا طول الأمعاء بشكل كاف، وقطع القاصي الأمعاء والمعدة والأقرب إلى الأعور لإعداد الدقاق. لإعداد الأمعاء الغليظة، وقطع القاصي القولون الأعور والأقرب إلى المستقيم. بسرعة إزالة جزء الأمعاء ووضعه في كوب مع وسائل الاعلام DMEM / F12 تستكمل مع 3 ميكرومتر نيكارديبين هيدروكلوريد و 1 ميكرومتر سكوبولامين هيدروكلوريد (المشار إليها فيما يلي باسم "وسائل الإعلام") على الجليد. إضافة هذه المثبطات تسهل تسليخ مجهري والتصوير لاحق عن طريق شل العضلات الملساء الأمعاء. شريحة قطع من الفائدة (على سبيل المثال، الصائم، اللفائفي والقولون البعيدة أو القريبة) على أساس علامات تشريحية المعمول بها. utiliz عادةالبريد الأنسجة من الدقاق البعيدة أو القولون البعيدة. ومع ذلك، استخدام نفس الإجراء الأساسي لعزل، تحميل والصورة الخلايا العصبية العضلية المعوية والدبقية في جميع المناطق المعوية. إزالة شريحة صغيرة (4-6 سم) من شريحة الأمعاء المطلوب وضعها في طبق بتري Sylgard المغلفة مليئة سائل الإعلام المبردة. تأمين القريبة والبعيدة نهايات الجزء الأمعاء مع دبابيس الحشرات وفتح أنبوب الأمعاء عن طريق جعل على التوالي، وقطع بالطول على طول الحدود المساريقي. دبوس الأنسجة مسطحة تحت التوتر الخفيف مع الجانب الغشاء المخاطي صعودا وبعناية تشريح بعيدا طبقة المخاطية باستخدام ملقط غرامة (رقم 5 و 5/45 عمل أفضل) ومقص الربيع الجميلة جدا. ملاحظة: إزالة الغشاء المخاطي يمكن أن تكون مؤلمة جدا لENS إذا لم تفعل بشكل صحيح. للتحضير الجودة، ورعاية للحد من إزالة مفاجئة من الغشاء المخاطي عن طريق تقشير أو كشط. أفضل الممارسات لرفع الغشاء المخاطي وقطع تحت مع مقص غرامة. قطع الأنسجة في إعداد أصغرالصورة (حوالي 0.5 سم 2) ودبوس في أطباق التصوير (4 زوايا مع طبقة العضلات الدائرية التي تواجه متابعة) وضعت على الجليد مع وسائل الإعلام الطازجة. تشريح بعناية بعيدا عضلة الدائرية التي كتبها إغاظة بعيدا مع ملاقط غرامة لفضح الضفيرة العضلية المعوية. تجنب الإفراط في التمدد. وضع طبق التصوير مرة أخرى على الجليد والتغيير حل مع وسائل الإعلام الطازجة. إعداد 2 مل من مزيج انزيم في طبق [Dispase 1 U / مل (4.48 ملغ / 8 مل)، كولاجيناز النوع الثاني 150 U / مل (5.45 ملغ / 8 مل) في وسائل الإعلام]. إزالة أطباق من الجليد وإضافة مزيج انزيم من الخطوة 1.13. احتضان الأطباق في RT لمدة 15 دقيقة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية. غسل الاستعدادات الأنسجة مع وسائل الاعلام 3 مرات وزوايا إعادة دبوس. 2. تحميل فلوو-4 صبغ ملاحظة: تجنب photobleaching من خلال العمل مع ضوء محدود أثناء التعامل مع الأصباغ الفلورية والأنسجة محملة الأصباغ المؤشر. إعداد 4 ميكرومتر فلوو-4 حل التحميل. إضافة 1.5 مل سائل الإعلام و 1.2 ميكرولتر من 250 ملي الأسهم البروبينسيد إلى قسامة 1.5 ميكرولتر من 4 مم فلوو-4 المخزون. ويتم إعداد 4 ملي فلوو-4 الأسهم عن طريق إضافة 11.4 ميكرولتر من pluronic F-127 (20٪ في DMSO، على أن تستكمل مع 0.25٪ cremaphor-EL) إلى 50 ميكروغرام من فلوو-4، AM. احتضان محضرات في فلوو-4 الحل تحميل لمدة 45 دقيقة في حاضنة مظلمة عند 37 درجة مئوية. إزالة من الحاضنة وغسل الاستعدادات مع وسائل الاعلام 3 مرات. وسائل الإعلام مقابل وسائل الإعلام التي تحتوي على 200 ميكرومتر البروبينسيد واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التصوير. ملاحظة: بالبروبنيسيد هو الدواء الذي يمنع النقل المقاومة للأدوية المتعددة في الخلايا العصبية. بالإضافة لهذا الدواء يمنع قدرة الخلايا العصبية لبثق الأصباغ ويعزز وضع العلامات العصبية. السائبة التحميل من الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر في غياب البروبينسيد تنتج أساسا الدبقية تحميل الخلية. إضافة البروبينسيد تسمح لرؤية الردود العصبية والدبقية. إعداد التعديل KREبكالوريوس العازلة. جعل منطقة عازلة كريبس المعدلة مثل أن تركيزات النهائية (مم) من المكونات هي على النحو التالي: 121 كلوريد الصوديوم، و 5.9 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 1.2 ناه 2 PO 4، 10 HEPES، 21.2 NaHCO 3، 1 البيروفيك حمض و 8 الجلوكوز (درجة الحموضة تعديل إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). إضافة 3 ميكرومتر نيكارديبين و1 ميكرومتر سكوبولامين لمنع تقلصات العضلات أثناء الكالسيوم 2+ التصوير وكله يشن تشريح. 3. التصوير وتحليل ملاحظة: استخدام ما لا يقل عن تلاعب التصوير الأساسي مع مصدر ضوء الفلورسنت، المجهر، وكاميرا CCD الجودة وبرنامج الحصول المناسب. تختلف إضافة مكونات أخرى اعتمادا على مصدر الضوء وتطبيق معين. يجب استخدام عجلة تصفية ومصراع مع مصدر ضوء زينون التقليدي القوس. ومع ذلك، مصادر الضوء LED وأنظمة الإضاءة لا تتطلب هذه المكونات. ضع تفصيلأوردينج غرفة تحت المجهر وباستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية مع عدة خزانات حقنة ساخنة تحديد معدل نضح المستمر من 2-3 مل / دقيقة من 37 درجة مئوية كريبس العازلة. تأكد لمنع تشكيل فقاعة الهواء في كل من المدخلات وشفط خط متصل فخ الفراغ. جلب الضفيرة المطلوب في التركيز تحت إضاءة ساطعة المجال. تجنب تعريض الأنسجة، مما قد يؤدي إلى الصورة التبييض. دراسة تحميل فلوو-4 ضمن العقد وحدد العقد صحي للتصوير. وغير صحية العقد / التالفة تظهر تألق ذاتي أو منقط التشكل وينبغي ألا تستخدم للتصوير. مرة واحدة يتم تحديد العقدة، تحويل مسار الضوء إلى الكاميرا والحصول على صورة حية مع برنامج الحصول على الصور. تأكد من أن العقدة هي في التركيز وتعيين صورة ومعدل اقتناء والتعرض مرات. ملاحظة: سوف معدلات اكتساب صورة والأوقات تختلف تبعا لأحداث المحققين ترغب في تسجيل. بالنسبة لمعظم التجارب، صوريتم الحصول على تقليديا في 0.5-1 هرتز للخلايا الدبقية وتصل إلى 2-10 هرتز لالخلايا العصبية بسبب ردود الدبقية الكالسيوم 2+ ليست سريعة مثل الكالسيوم 2+ العابرين في الخلايا العصبية. تبدأ التجربة وإقامة النشاط الأساسي لمدة 30 ثانية. تطبيق المخدرات قبل تحسنت ذات الأهمية مثل منبهات مستقبلات ومضادات باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل 2-3 مل / دقيقة. اتبع تطبيق منبهات / الخصوم من خلال العودة إلى نضح من العازلة العادي والسماح لفترة الغسيل / استرداد 10 دقيقة على الأقل. ملاحظة: تختلف الأوقات تطبيق المخدرات تبعا لمجمع الفردي والتصميم التجريبي. بشكل عام، تطبيق 20-30 ثانية من ناهض كافية لتنشيط مستقبلات البروتين G-يقترن في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ومع ذلك، القنوات الأيونية بوابات يجند (مثل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية) تتطلب مرة تطبيق لا يزيد عن 5-10 ثانية. سوف التعرض مدة أخرى تسبب يجند بوابات القنوات الأيونية لDESE بسرعةnsitize. وينبغي تطبيق الخصوم لحوالي 3-15 دقائق لضمان الحصار الكامل لمسارات مستقبلات. ومع ذلك، وهذا هو التعميم الإجمالي، وينبغي أن المحققين دائما تحسين أي دواء التجريبية في نموذج بصفة خاصة. إيقاف التسجيل وعرض الوقت الفاصل بين الفيلم التجربة. مناطق مختارة بعناية من الفائدة (ROI ل) باستخدام المناسب برنامج تحليل الصور. استخدام البرمجيات لتطبيع ومقارنة العائد على الاستثمار كثافة الفلورسنت ضد القيمة الأولية الفلورسنت خط الأساس. التغيرات في مضان تطبيع ويتناسب طرديا مع التغيرات في [كا 2+]. استخدام تعديل طريقة التي سبق وصفها باستخدام 26 ΔF / F = ((F 1 – F 0) / F 0) ROI – ((F 1 – F 0) / F 0) الخلفية، حيث F1 هو مضان في أي يعطى نقطة وF0 هي مضان خط الأساس، لتحسين دقة التقييم. يساعد هذا التعديلفي الحد من الضوضاء من التغييرات مضان في الاستعدادات الأنسجة التي تظهر حركة طبقة العضلات الكامنة وراء الضفيرة العضلية المعوية.

Representative Results

الاستخدام السليم لهذه التقنية تسمح للمحققين تقيس بدقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ [كا 2+] ط العابرين في الخلايا العصبية المعوية والدبقية في جبل لالجامع الاستعدادات الأنسجة. ويرد مثال ممثل ل-أثار ناهض الكالسيوم 2+ الردود في الدبقية ضمن العقدة العضلية المعوية من القولون الماوس في فيديو 1. وتهدف النتائج التالية لتوضيح بعض النتائج التمثيلية التي حصلنا عليها باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يوضح الشكل (2) ونتائج تجربة قياس الدبقية المعوية [كا 2+] ط التغييرات ردا على التحفيز عن طريق ATP داخل خنزير غينيا القولون طولية الضفيرة العضلية المعوية العضلات (LMMP) الاستعدادات. على وجه التحديد، ويظهر هذا الرقم أسلوب التحليل السليم للبروتوكول تجريبي المذكورة أعلاه بما في ذلك الخطوط العريضة للالعقدة، والنجمة تدل على مكان الخلايا العصبية العضلية المعوية المعوية تحليلها. هذه النتائج أيضا طllustrate الجرعة المثلى من مائة ATP مكرومولي على تعبئة [كا 2+] i في خنزير غينيا الدبقية العضلية المعوية. هذا الرد يمكن أن تستخدم لمعايرة التحفيز الدبقية المعوي وتطبيع الردود على اختبار المحفزات. وبعد ذلك، بالتعريف الشكل (3) كيفية تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية بشكل صحيح، كما هو موضح مع توضيح الدوائر الصفراء. تظهر هذه النتائج أيضا التغييرات مضان المطلوب في ظل الظروف القاعدية واستجابة للمؤثرات الدوائية. وأخيرا، يوضح الشكل 4 الاعتبارات المكانية لاختيار الدبقية المعوية والخلايا العصبية ل[كا 2+] ط الردود في الاستعدادات الكاملة جبل. الشكل 1. منظمة ENS. وتتضمن ENS اثنين من الضفائر عقدي الرئيسية. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين لطبقات العضلات ongitudinal ودائرية. يقع الضفيرة تحت المخاطية بين الغشاء المخاطي وطبقة العضلات الدائرية. وتتألف ENS فقط من الخلايا العصبية والدبقية المعوية. مساحات الألياف العصبية تربط العقد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. المعوية الدبقية في خنزير غينيا القولون الضفيرة العضلية المعوية الاستجابة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) فلوو-4 مضان في العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع) في ظل الظروف القاعدية. وتشير الأسهم لمساحات سميكة من الألياف بين العقد. (ب) عند التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية، ولكن ليس الخلايا العصبية، وزيادة بسرعة فلوو-4 مضان مما يشير إلى زيادة في [كا 2+] <sUB> ط. لاحظ أن خلايا الاستجابة صغيرة وتحيط الخلايا العصبية أكبر من ذلك بكثير (الأماكن المظلمة تميزت العلامات النجمية). (C) الدبقية المعوية تستجيب لATP بطريقة تعتمد على الجرعة مع 1 مليمول / L مثيرة لاستجابات القصوى 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. الفئران S-100-GFP + الخلايا في القولون العضلي المعوي الاستجابة الضفيرة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) S-100-GFP + الخلايا الدبقية (الأخضر) في الماوس القولون العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع). وتظهر ست مناطق من الفائدة (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية ضمن العقد كما الدوائر الصفراء. السهام تشير مساحات الألياف سميكة المؤدية إلى العقدة. النجمة دموقع enote من 2 الخلايا العصبية المعوية. (ب) نفس العقدة تظهر Rhod-2 مضان في ظل ظروف القاعدية. (C) وبعد التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية تستجيب مع زيادة [كا 2+] أنا كما يتضح من زيادة Rhod- 2 مضان. (D) آثار المقابلة لكل ROI هو مبين في A-C. (E) بلغ متوسط ​​استجابة (يعني ± SEM) من 6 رويس هو مبين في D 24. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. في مجال التصوير الموقع من المعوي الاتصالات العصبية إلى الدبقية. (A) صور الممثل (pseudocolored) من تجربة التصوير الكالسيوم 2+ حيث كله جبلوطعن إعداد الضفيرة العضلية المعوية مع الخلايا العصبية P2X7 مستقبلات ناهض BzATP (100 ميكرومتر، 30 ثانية). لاحظ أن ناهض العصبية يسبب زيادة في Fluo4 مضان في الخلايا العصبية (A ') قبل المحيطة بها الخلايا الدبقية المعوية (A "). (ب) تحليل التغير في مضان على مر الزمن في الدبقية (الأزرق) والخلايا العصبية (الحمراء ) بعد تطبيق ناهض الخلايا العصبية، BzATP. (C) العصبية واستجابات الدبقية لBzATP في المخزن العادي (خطوط الصلبة) وفي العازلة التي تحتوي على الكالسيوم منخفض 2+ والمغنيسيوم 2+ (الخطوط المتقطعة) لتحفيز مستقبلات P2X7 العصبية (13). من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. فيديو 1. أثار ناهض الكالسيوم 2+ رد في الدبقية المعوية فيالموقع. يظهر هذا الفيديو على العقدة العضلية المعوية من القولون البعيدة الماوس محملة كا 2+ صبغ المؤشر، فلوو-4. ناهض الخلايا الدبقية، ADP، يضاف إلى الحمام عند اللزوم. ADP يتسبب زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا الدبقية في 2+ المعوية كما لوحظ من خلال الارتفاع عابر في فلوو-4 مضان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

Discussion

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca²⁺ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.

In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.

Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations ²⁷. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP ². The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus ²⁸. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.

In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis ²⁹. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

Materials

Name	Company	Catalog Number
BubbleStop Syringe Heater	AutoMate Scientific	10-4-35-G
CaCl2	Sigma	C3306
Collagenase, Type II, powder	Gibco	17101-015
Dispase	Sigma-Aldrich	42613-33-2
Dissection tools	Roboz
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Fixed-stage microscope	Olympus	BX51WI
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
KCl	Sigma	P3911
MgCl2	Sigma	M9272
NaCl	Sigma	S9888
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Perfusion chamber	Custom
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecular Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C