Summary

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015
doi:

Summary

La listeria monocytogenes causa infezioni fetali nelle donne in gravidanza e meningite nelle popolazioni sensibili. Le sottopopolazioni di batteri possono colonizzare il tessuto cardiaco, causando miocardite in pazienti e animali da laboratorio. Qui presentiamo un protocollo che descrive come valutare l’invasione delle cellule cardiache di L. monocytogenes in vitro e la colonizzazione cardiaca negli animali infetti.

Abstract

Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facultativo Gram-positivo in grado di causare gravi infezioni invasive in pazienti immunocompro compromessi, anziani e donne in gravidanza. Le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani includono meningite, encefalite e aborto fetale. Una sequela significativa ma molto meno documentata dell’infezione invasiva di L. monocytogenes coinvolge il cuore. Il tasso di mortalità per malattia cardiaca può essere fino al 35% nonostante il trattamento, tuttavia si sa molto poco per quanto riguarda la colonizzazione L. monocytogenes del tessuto cardiaco e le sue patologie risultanti. Inoltre, è recentemente diventato evidente che le sottopopolazioni di L. monocytogenes hanno una maggiore capacità di invadere e crescere all’interno del tessuto cardiaco. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il cardiotropismo degli isolati L. monocytogenes. Sono presentati metodi per l’infezione dei mioblasti cardiaci del ratto H9c2 nella coltura tissutale e per la determinazione della colonizzazione batterica dei cuori dei topi infetti. Questi metodi sono utili non solo per identificare i ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma possono anche facilitare l’identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l’invasione delle cellule cardiache e / o guidare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi prevedono anche il confronto diretto del cardiotropismo tra più ceppi di L. monocytogenes.

Introduction

La Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare gram-positivo in grado di causare gravi malattie nelle popolazioni sensibili, tra cui anziani, donne incinte, persone con HIV / AIDS e persone che ricevono la chemioterapia1. L’infezione in queste popolazioni è spesso il risultato dell’ingestione di prodotti alimentari contaminati e la maggior parte delle infezioni sono associate a focolai di origine alimentare su largascala 2,3. Nell’uomo e in altri mammiferi, L. monocytogenes è in grado di trasporre attraverso il confine epiteliale dell’intestino tenue, per poi essere trasportato al fegato4,5. I modelli animali suggeriscono che i batteri ingeriti si replicano all’interno dei villi intestinali e transitano al fegato attraverso la vena portale o si diffondono attraverso i linfonodi mesenterici nel flusso sanguigno, portando alla diffusione ematogena al fegato e alla milza6,7. Nel fegato e nella milza, il batterio è in grado di mediare l’assorbimento sia nei fagociti professionisti che nelle cellule parenchimali residenti e stabilisce rapidamente infezioni all’interno di questi organi. Con l’aumentare della carica batterica, numerosi batteri vengono dispersi nel sangue, dove sono in grado di colonizzare ulteriormente i tessuti sensibili tra cui il sistema nervoso centrale e la placenta (dove presente). La colonizzazione di questi siti preclude le manifestazioni più comuni di listeriosi negli esseri umani, tra cui meningite, encefalite e aborto fetale2.

Alcune sottopopolazioni di L. monocitogene hanno recentemente dimostrato di avere una maggiore capacità di invadere e replicare all’interno del tessuto cardiaco8. Le manifestazioni di coinvolgimento cardiaco sono varie e vanno dall’endocardite e pericardite, alla miocardite fulminante completa di anomalie di conduzione9-13. Il numero complessivo di casi cardiaci L. monocytogenes all’anno è basso, ma può essere sottovalutato in quanto questo aspetto dell’infezione non è generalmente ben riconosciuto. La colonizzazione del cuore da parte di agenti patogeni richiede spesso predisposizioni ospiti come danni valvulari preesiste o valvole cardiache artificiali. Esistono, tuttavia, isolati di L. monocytogenes che sono stati identificati che si notano per la loro capacità di colonizzare il cuore degli animali infetti in assenza di danni cardiaci e/o anomalie8.

Nel presente documento sono descritti metodi in vitro e in vivo per valutare la colonizzazione batterica del tessuto cardiaco all’interno di animali infetti utilizzando test di invasione nella coltura tissutale e infezioni animali vive. Questi metodi si sono dimostrati utili non solo per identificare ceppi con il potenziale di colonizzare il tessuto cardiaco negli animali infetti, ma dovrebbero anche essere utili per l’identificazione di prodotti genetici batterici che servono a migliorare l’invasione delle cellule cardiache e / o provocare cambiamenti nella patologia cardiaca. Questi metodi facilitano il confronto del cardiotropismo tra più ceppi. Per i metodi qui descritti, L. monocytogenes 10403S è usato come rappresentante ben studiato di un ceppo non cardiotropico e l’isolato clinico 07PF0776 è usato come esempio rappresentativo di un ceppo cardiotropico. Questi due ceppi sono stati scelti per fornire un confronto per l’invasione batterica di cellule cardiache in vitro e la colonizzazione dei cuori dei topi infetti in vivo. L’isolato 07PF0776 è un isolato clinico recuperato da un ascesso interventricolare che ha causato un’aritmia fatale in un paziente HIV+8. L. gli isolati monocitogeni possono variare nel loro potenziale di virulenza e, data la propensione della Listeria a infettare le persone con immunosoppressione e le donne incinte, le persone all’interno di queste popolazioni dovrebbero prestare attenzione nel valutare diversi isolati clinici.

Protocol

1. Condizioni di conservazione e coltura per i ceppi di L. monocitogeni Preparare i supporti solidi autoclavando l’agar per infusione cervello-cuore (BHI) e versando il supporto fuso nelle piastre di Petri. Lasciare asciugare le piastre durante la notte a temperatura ambiente, quindi pernottare di nuovo a 37 °C. Utilizzando un ciclo sterile, ottenere un piccolo campione di L. monocitogenes da scorte congelatori precedentemente realizzate (batteri sospesi al 20% di glicerolo in mezz…

Representative Results

Isolati selezionati di L. monocytogenes mostrano una maggiore invasione delle cellule cardiache nella coltura cellulare e nei modelli di infezione dei topi. La figura 1 mostra un esempio di come le colonie batteriche possano apparire a seguito della placcatura spot delle sospensioni sui mezzi agar. Questo metodo consente una valutazione accurata dei CFC all’interno di un campione senza utilizzare un gran numero di piastre di supporto agar. La figura 2 mostra un esempio di saggio…

Discussion

L. monocytogenes è un agente patogeno umano diffuso e ben caratterizzato, in grado di causare una serie di diverse manifestazioni di malattia15. Il batterio è stato precedentemente descritto per la sua capacità di trasporre attraverso barriere, come la barriera ematico-encefalica e le barriere placentare-fetali, al fine di raggiungere e colonizzare il sistema nervoso centrale e sviluppare il feto, rispettivamente. La capacità in vivo dell’organismo di colonizzare questi tessuti è spesso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e da F31AI094886-01 (P.D.M.) di NIAID. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali delle fonti di finanziamento.

Materials

Difco BHI Broth Base 237200 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2KG of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14mL Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75cm^2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

References

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Cite This Article
McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

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