Summary

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015
doi:

Summary

Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten.

Abstract

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver fakultativer intrazellulärer Erreger, der in der Lage ist, schwere invasive Infektionen bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Schwangeren zu verursachen. Die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen sind Meningitis, Enzephalitis und fetale Abtreibung. Eine signifikante, aber viel weniger dokumentierte Fortsetzung der invasiven L. monocytogenes Infektion betrifft das Herz. Die Sterblichkeitsrate durch Herzerkrankungen kann trotz Behandlung bis zu 35% betragen, allerdings ist sehr wenig über die Besiedlung von Herzgewebe und deren folgenden Pathologien bekannt. Darüber hinaus hat sich in jüngster Zeit gezeigt, dass Subpopulationen von L. monocytogenes eine verbesserte Fähigkeit haben, in Herzgewebe einzudringen und zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt detailliert In-vitro- und In-vivo-Methoden, die zur Beurteilung des Kardiographenvon L. monocytogenes Isolate verwendet werden können. Methoden werden zur Infektion von H9c2-Ratten-Herzmyoblasten in der Gewebekultur sowie zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Herzen infizierter Mäuse vorgestellt. Diese Methoden sind nicht nur nützlich, um Stämme mit dem Potenzial zu identifizieren, Herzgewebe bei infizierten Tieren zu besiedeln, sondern können auch die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten erleichtern, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder Veränderungen in der Herzpathologie voranzutreiben. Diese Methoden sehen auch den direkten Vergleich des Kardiontropismus zwischen mehreren L. monocytogenes Stämmen vor.

Introduction

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver intrazellulärer Erreger, der schwere Krankheiten in anfälligen Populationen verursachen kann, einschließlich älterer Menschen, Schwangerer, HIV/AIDS-Patienten und Patienten, die eine Chemotherapie erhalten1. Infektionen in diesen Populationen sind häufig das Ergebnis der Einnahme kontaminierter Lebensmittel, und die meisten Infektionen sind mit großangelegten lebensmittelbedingten Ausbrüchen verbunden2,3. Bei Menschen und anderen Säugetieren ist L. monocytogenes in der Lage, sich über die Epithelgrenze des Dünndarms zu transortieren und anschließend in die Leber transportiert zu werden4,5. Tiermodelle deuten darauf hin, dass aufgenommene Bakterien sich innerhalb der Darmzotten vermehren und durch die Portalvene in die Leber gelangen oder sich über die mesenterischen Lymphknoten in den Blutkreislauf ausbreiten, was zu einer hämatogenen Verbreitung in der Leber und Milz6,7führt. In der Leber und Milz ist das Bakterium in der Lage, sowohl in professionelle Phagozyten als auch in ansässigen parenchymalen Zellen zu vermitteln und stellt schnell Infektionen in diesen Organen her. Mit zunehmender bakterieller Belastung werden zahlreiche Bakterien wieder ins Blut verteilt, wo sie in der Lage sind, empfängliche Gewebe, einschließlich des zentralen Nervensystems und der Plazenta (sofern vorhanden), weiter zu besiedeln. Kolonisierung dieser Standorte schließt die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen, einschließlich Meningitis, Enzephalitis, und fetale Abtreibung2.

Ausgewählte Subpopulationen von L. monocytogenes haben vor kurzem gezeigt, dass eine verbesserte Fähigkeit, in Herzgewebe eindringen und replizieren8. Manifestationen der Herzbeteiligung sind vielfältig und reichen von Endokarditis und Perikarditis bis hin zu fulminanten Myokarditis mit Leitstörungen9-13. Die Gesamtzahl der L. monocytogenes Herzfälle pro Jahr ist gering, kann aber unterschätzt werden, da diese Facette der Infektion im Allgemeinen nicht gut erkannt wird. Die Besiedlung des Herzens durch Krankheitserreger erfordert oft Wirtsveranlagungen wie bereits bestehende Valvularschäden oder künstliche Herzklappen. Es gibt jedoch Isolate von L. monocytogenes, die identifiziert wurden, die für ihre Fähigkeit, die Herzen der infizierten Tiere in Ermangelung von Herzschäden und/oder Anomalien8zu besiedeln bemerkenswert sind.

Hierin werden in vitro und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Besiedlung von Herzgewebe in infizierten Tieren mit Invasions-Assays in der Gewebekultur sowie lebenden Tierinfektionen beschrieben. Diese Methoden haben sich nicht nur bei der Identifizierung von Stämmen mit dem Potenzial zur Besiedlung von Herzgewebe bei infizierten Tieren als nützlich erwiesen, sondern sollten auch für die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten nützlich sein, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder zu Veränderungen in der Herzpathologie führen. Diese Methoden erleichtern den Vergleich des Kardiographen zwischen mehreren Stämmen. Für die hier beschriebenen Methoden wird L. monocytogenes 10403S als gut untersuchter Vertreter eines nichtkardiotropen Stammes und das klinische Isolat 07PF0776 als repräsentatives Beispiel für einen kardiotropen Stamm verwendet. Diese beiden Stämme wurden ausgewählt, um einen Vergleich für die bakterielle Invasion von Herzzellen in vitro und die Besiedlung von Herzen infizierter Mäuse in vivozu liefern. Das Isolat 07PF0776 ist ein klinisches Isolat, das aus einem interventrikulären Abszess gewonnen wurde, der bei einem HIV+-Patienten eine tödliche Arrhythmie verursachte8. L. Monocytogenes-Isolate können in ihrem Virulenzpotenzial variieren, und angesichts der Neigung für Listerien, Personen mit Immunsuppression zu infizieren und Schwangere, sollten Personen innerhalb dieser Populationen bei der Beurteilung verschiedener klinischer Isolate Vorsicht walten lassen.

Protocol

1. Lagerungs- und Kulturbedingungen für L. monocytogenes Stämme Bereiten Sie feste Medien vor, indem Sie Hirn-Herz-Infusionsagar (BHI) autoklavieren und die geschmolzenen Medien in Petriplatten gießen. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, dann wieder bei 37 °C. Mit einer sterilen Schleife eine kleine Probe von L. monocytogenes aus zuvor hergestellten Gefrierbeständen (Bakterien, die in 20% Glycerin in Flüssigmedien von BHI suspendiert sind, bei -80 °…

Representative Results

Ausgewählte Isolate von L. monocytogenes zeigen eine verbesserte Invasion von Herzzellen in der Zellkultur und in Mausmodellen der Infektion. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür, wie bakterielle Kolonien nach der Fleckbeschichtung von Suspensionen auf Agarmedien auftreten können. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung von KBE innerhalb einer Probe, ohne eine große Anzahl von Agar-Medienplatten zu verwenden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen gewebekulturba…

Discussion

L. monocytogenes ist ein weit verbreiteter und gut charakterisierter menschlicher Erreger, der in der Lage ist, eine Reihe verschiedener Krankheitserscheinungen zu verursachen15. Das Bakterium wurde zuvor für seine Fähigkeit beschrieben, über Barrieren, wie die Blut-Hirn-Barriere und Plazenta-fetale Barrieren zu translozieren, um das zentrale Nervensystem zu erreichen und zu besiedeln bzw. Fötus zu entwickeln. Die In-vivo-Fähigkeit des Organismus, diese Gewebe zu besiedeln, wird oft durc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des öffentlichen Gesundheitsdienstes AI41816 und AI099339 (N.E.F.) sowie durch F31AI094886-01 (P.D.M.) von NIAID unterstützt. Die Inhalte liegen allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen dar.

Materials

Difco BHI Broth Base 237200 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2KG of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14mL Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75cm^2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Play Video

Cite This Article
McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

View Video