Summary

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

Published: February 11, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Abstract

İlk floresan etiketli, yapışkan olmayan, insan veya murin efektör bağışıklık hücrelerinin hareketliliği ölçmek için, hücre dışı matris proteinleri üzerinde yapışık tümör hücrelerinin radyal migrasyonun ölçülmesi için rapor Radyal tabakalı hücre gücü deneyi yeni bir adaptasyon sunulmaktadır. Bu teknik bir paslanmaz çelik manifoldu ve 10-kuyu teflon slayt fokal birleşen tümör hücre mono tabakaları veya hücre dışı matriks proteinleri ya hazırlanan kuyulara yapışmaz T hücrelerini yatırmak için kullanır. Hafif ve / veya çok-kanallı floresan mikroskobu zamanla efektör hücrelerin hareketi ve davranışını izlemek için kullanılır. Floresan boyalar ve / veya floresan transgenler için kod diferansiyel görüntüleme için hücre tipleri etiketlemek için kullanılan viral vektörler. Bu yöntem, bir slayt bölmeleri, agar veya Transwell plakaları kullanılarak, yatay ya da dikey göç / işgali etiket in vitro deneyler içindeki tip farklıdır. Tahlil ayrıntılı görüntüleme verileri b sağlarBelirli bir fluoresan markörler ile ayırt farklı hücre tipleri ile toplanmış, e; hücrelerin hatta belirli alt gruplar (örneğin, nontransduced / transdüksiyon ile aktarılabilir) izlenebilir. Yüzey yoğunluklu floresan araziler göç hücre tipine karşılık gelen özel flüoresan kanalları kullanılarak üretilir. Bu belirli zamanlarda yapışkan olmayan immün hücre hareketliliğinin iyi olarak gösterebilir. Bir de, hedef hücrelere gibi sitotoksisite veya efektör viral vektörlerin transferi gibi diğer efektör hücre fonksiyonlarının, kanıt toplamak mümkündür. Bu durumda, yöntem, araştırmacılar mikroskobik çeşitli yapışkan hücreler ile farklı olarak etiketli olmayan yapışık hücre-hücre etkileşimleri belge sağlar. Bu tür bilgiler, işlevselliği görsel kanıt, kanser tedavisi için kullanılmadan önce tümör hedef hücreleri ile arzu edilen biyolojik olarak manipüle ya da aktive edilmiş immun hücre tiplerinin belirlenmesinde, özellikle uygun olabilir.

Introduction

Radyal tabakalı hücre gücü deneyi ilk olarak, hücre dışı matris (ECM), proteinleri 5-7 ile ya da fibronektin ve laminin 1,2 tek tek ECM bileşenleri ile kaplanmış dilimlerin üzerine yapışık tümör hücreleri 1-4 infiltratif özelliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu teknik, paslanmaz çelik bir hücre, sedimantasyon manifoldu (CSM) kullanılarak kuyu merkezinde tümör hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu tohumlama çıkıyor. Sedimantasyon sonra, tümör hücreleri, yatay motilite oranı belirlemek üzere kullanılan kuyu ve zaman içinde başlangıç ​​hücre popülasyonunda çapında değişiklik alt azaltacaklardır. Radyal tabakalı hücre gücü deneyi hücrelerinin in vitro göç yeteneklerine tahlil edilmesi Transwell plakaları kullanılan diğer mevcut yöntemlere göre görsel bir avantaj sağlanır; Bu analizler görüntüleme 8 olmayan elverişli. Yanı sıra, aynı zamanda bir zaman noktası seçiminde özgürlük büyük miktarda sağladıgöç, değerlendirilir timepoints sayısında herhangi bir sınır ile bir araştırmacı sedimantasyon sonra görüntünün tercih ne zaman s.

Geçirmek için yeteneği, özellikle de viral vektörler için salıverme araçları olarak kullanılabilir immünoterapi veya burada alanında, yapışkan olmayan hücreler için önemli bir işlevi olduğu için, yapışkan olmayan hücre göçünü değerlendirmek için CSM kullanımını uyarlanmış tümör hücre tekli katmanları üzerinde tipleri, ECM proteinleri ilave olarak. Mikroskopik olarak, ya da tek tek ECM bileşenleri tümöründen izole edilmiş kompleks ECM ile, uygun bir tümör hücre tekli katmanları üzerinde yapışkan olmayan hücreleri göç görselleştirme yararı, bu deney, çok yönlü kılar. Tek bir hücre dışı bir protein ile kaplı oyuklar da kullanan deneyler doğru hücrelerin, in vivo yoluyla göç edecektir ECM doku alt-tabakanın ya da tümör yansıtmamaktadır.

Burada, biz büyük histocomp karşı duyarlı alloreaktif sitotoksik T lenfositleri (alloCTL), kullanılanBizim için temsili yapışmayan hücre tipi olarak, tek yönlü karma lenfosit tümör hücresi tepkileri (MLTR) ya da karışık lenfosit reaksiyonları (MLR), 9 kullanarak atibility kompleksi (MHC) proteinleri içerir. Biz de, insan ve murin kökenli hücreler test edildi. Göç tümör mono tabakaları üzerinde ölçüldü zaman kullanılan tümör hücreleri ya kısmen ilgili hedefler MHC moleküllerinin tam bir set ile efektörler, ya da tamamen ilgili hedefler, duyarlı kullanılan hücre popülasyonu üzerinde bulunan aynı MHC proteinlerinin bazı görüntüleme, olduğunu etkileyiciler karşı duyarlı hale getirilmiş. Bazı deneylerde, efektör ve hedef hücrelerin ayırt etmek için floresan CellTracker Kırmızı CMPTX veya hücre çoğalması, boya eFluor 670 kullanılır. Ayrıca hücrelerin görselleştirmek için ek bir yol olarak floresan proteinler için viral vektörler, kodlama ile transdüksiyon kullanılır. Bazı deneyler için, Emerald Green (Merck) floresan protein 10,11 kodlayan retroviral replike vektörleri (RRV) ile alloCTL transduse; oth içinalıcılar, tümör hücreleri mStrawberry kodlayan lentiviral vektörleri ile transdüse edilmiştir.

alloCTL tümör hücre monokatmanlarından hasat edilen tümör hücre mono tabakaları ya da ECM ya merkezine manifoldunun bir kanal üzerinden ekilmiştir. Yapışkan olmayan yapışık hücre etkileşimleri ışık ve / veya zaman içinde floresan mikroskobu ile görülür hale getirilirler. Yüksek güçte parçalanmış çekirdekleri ile düşük güçte tümör hücre mono tabakasında bozulması ya da tümör hücreleri, sırasıyla erime ve apoptoz ile hücre hasarı göstergeleri idi. Biz dijital tek tabaka kültürler üzerinde yapışmaz floresanlama T hücrelerinin göçünü gösteren yüzey yoğunluğu floresan haritalar yarattı. Biz de sitotoksisite Kaplanmış yapışmayan alloCTL küme oluşumundan sonra yapışık glioma hücre tabakasına yol açtığı kaydetti. Yanı sıra, glioma tek tabaka için alloCTL gelen RRV-EMD yatay transdüksiyon gözlendi.

Protocol

1. Slayt Hazırlama Sterilizasyon torbalar içine Hücre Sedimantasyon Manifold slaytlar yerleştirin ve otoklav bandı ile mühür. Kese kağıdı tarafı kuyuları plastik birikmeleri önlemek için slayt Teflon kaplı yan Yüz. 121 ° C'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır torbalar. Steril 150 x 15 mm steril Petri kabındaki bir biyogüvenlik kabini ve yerin içinde sterilizasyon kese slaytı çıkarın. Dört slaytlar kadar tabak başına sığabilir. Slaytlar yanında 35 x 10…

Representative Results

Floresan proteinleri kodlayan viral vektörler ya da bunun yerine, floresan boya, bir ek olarak kullanılabilir. Viral transdüksiyon motilite deneyinin önceden yapılmalıdır. Hem yapışkan ve yapışkan olmayan hücre tipleri farklı şekilde etiketlenmiş olabilir. transdüksiyonu için protokol kullanılan vektör tipine bağlı olacaktır. Burada, 12 'de tanımlanan protokol kullanılarak gerçekleştirilen bir deneyde önceden Şekil RRV EMD ile birlikte 3, 5 ve …

Discussion

Tek bir hücre süspansiyonu olarak tümör hücreleri Teflon-maskeli sürgü oyuklarına pipetle alındı. hücreler yapışmaya bırakıldı ve daha sonra bir nemlendirilmiş bir% 5 CO2, 37 ° C inkübatör (Şekil 1A) içinde tek-tabakalar oluşturulmuştur. Tek tabaka elde kurulan tek tabakalar ya da ECM proteinlerinin bu tahlillerde (Şekil 1B) hasat edilebilir. EMD kodlayan vektörler ile önemli bir floresan boya ile işaretlenmiş ya da transduse efektör T lenfositle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Hibe Numarası UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 ve Joan S. Holmes Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. MJH ve GCO UCLA Joan S. Holmes Memorial Doktora Sonrası Bursu desteklenen aldı. CSM cihaz Yaratıcı Bilimsel Yöntemleri elde edilmiştir: www.creative-sci.com. Lentiviral vektör KÜR / P30 DK041301 tarafından desteklenen UCLA Vektör Core, alındı.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Teflon-masked microscope slides Creative Scientific Methods CSM002
Cell Sedimentation Manifold Creative Scientific Methods CSM001
Petri Dish, 150mm Corning 430597
Petri Dish, 35mm Corning 430588
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Mediatech 21-040
20 μL Pipetman Gilson F123600
200 μL Pipetman Gilson F123601
200 μL pipette tips VWR 89003-060
Distilled, deionized water (sterile) Mediatech 25-055
Trypsin Mediatech 25-054-CL
Celltracker Red CMPTX Invitrogen C34552
TrypLE Express (optional) Gibco 12604
Tumor cell culture media (e.g. DMEM) Mediatech 10-013
AIM-V serum-free media Invitrogen 12055-083
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Inverted microscope
SPOT Advanced Diagnostic Instruments
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E
Fibronectin BD 354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches Crosstex SCXS2
Trypan Blue Mediatech 25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience 65-0840-85
ImageJ NIH

References

  1. Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
  2. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  3. Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
  4. Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
  5. Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
  6. Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
  7. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
  8. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  9. Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
  10. Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
  11. Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
  12. Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
  13. Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
  14. Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
  15. Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  17. Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
  18. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  19. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
  20. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
  21. Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).

Play Video

Cite This Article
Erickson, K. L., Hickey, M. J., Kato, Y., Malone, C. C., Owens, G. C., Prins, R. M., Liau, L. M., Kasahara, N., Kruse, C. A. Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (96), e52416, doi:10.3791/52416 (2015).

View Video