ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
まず、蛍光標識、非接着性ヒトまたはマウスエフェクター免疫細胞の運動性を測定するために、細胞外マトリックスタンパク質に付着した腫瘍細胞の半径方向移動を測定することが報告され、ラジアル単層細胞移動アッセイの新規適応を報告する。この技術は、ステンレス鋼製マニホールドと10ウェルテフロンスライドが局所的にコンフルエント腫瘍細胞単層または細胞外マトリックスタンパク質のいずれかを用いて調製したウェルに非接着T細胞を堆積するために使用する。光および/またはマルチチャネル蛍光顕微鏡は、経時的にエフェクター細胞の移動および動作を追跡するために使用される。蛍光色素および/または蛍光の導入遺伝子のためのコードは、示差的イメージングのための細胞型を標識するために使用されるウイルスベクター。この方法は、スライドチャンバー、寒天またはトランスウェルプレートを利用して、水平または垂直の遊走/浸潤を追跡するインビトロアッセイにおいて同様の型と区別される。アッセイは、詳細な撮像データをbを可能にする特定の蛍光マーカーで区別異なる細胞型で集めE;細胞（ すなわち 、形質導入し/形質導入された）であっても、特定の亜集団を監視することができる。表面強度の蛍光プロットが移行細胞型に対応する特定の蛍光チャネルを使用して生成される。これは、特定の時間に非接着性免疫細胞の移動性の良好な視覚化を可能にする。それは同様に、標的細胞へのエフェクターのようなウイルスベクターの細胞毒性または転送などの他のエフェクター細胞機能の証拠を収集することが可能である。したがって、この方法は、研究者が微視的に様々な種類の接着性細胞を示差的に標識され、非接着性の細胞間の相互作用を記録することができる。このような情報は、機能の視覚的な証拠は、癌治療のためのそれらの使用の前に腫瘍標的細胞に所望される生物学的に操作されまたは活性化免疫細胞型の評価に特に関連し得る。
Introduction
ラジアル単層細胞遊走アッセイは、本来細胞外マトリックス（ECM）タンパク質5-7またはフィブロネクチンまたはラミニン1,2のような個々のECM成分でコーティングされたスライド上に付着した腫瘍細胞1-4の浸潤特性を測定するために開発された。技術は、ステンレス鋼、細胞沈殿マニホールド（CSM）を使用して、ウェルの中心における腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を播種関わる。沈降した後、腫瘍細胞がウェルの底に付着すると、経時的な最初の細胞集団の直径の変化は、水平運動の速度を確立するために使用した。ラジアル単層細胞遊走アッセイは、細胞のインビトロ渡り鳥の能力をアッセイするトランスウェルプレートを採用し、他の既存の方法より視覚的な利点を提供した。これらのアッセイは、イメージング8非資する。同様に、それはまた、時点の選択の自由度を多量に提供移行が、評価される時点の数に制限して、研究者が沈降した後の画像に選択することができるときだ。
移行する能力は、特に免疫療法の領域、またはどこにウイルスベクターのための送達ビヒクルとして使用することができる、非接着細胞のために重要な機能であるため、我々は、非接着性細胞の遊走を評価するためにCSMを使用するように適合ECMタンパク質に加えて、腫瘍細胞の単層上型。顕微鏡的に、または個々のECMコンポーネントの腫瘍から単離された複雑なECMに、生存腫瘍細胞単層上の非付着性細胞の遊走を可視化するという追加の利点は、このアッセイは、汎用性になる。シングル細胞外タンパク質でコーティングしたウェルを採用するアッセイは正確に細胞が生体内で通って移動したいのECM組織基質または腫瘍を反映するものではありません。
ここでは、主要なhistocompに感作、アロ反応性細胞傷害性Tリンパ球（alloCTL）を使用一方向混合リンパ球腫瘍細胞反応（MLTR）または私達の代表的な非付着性の細胞型などの混合リンパ球反応（MLR）9を使用して、複合体（MHC）タンパク質atibility。我々は両方のヒトおよびマウス由来の細胞をテストした。移行が腫瘍単層上で測定したところ、採用された腫瘍細胞は部分的に関連する標的は、MHC分子の完全なセットのエフェクター、または完全に関連する標的を、感作するために使用される細胞集団に見られるのと同じMHCタンパク質の一部を表示し、あったことエフェクターは、向かって感作されていた。いくつかの実験では、エフェクター細胞および標的細胞を区別するために、蛍光CellTrackerレッドCMPTXまたは細胞増殖色素eFluor 670を使用する。我々はまた、細胞を可視化するための追加の方法などの蛍光タンパク質のためのウイルスベクターのエンコーディングで形質導入を使用していました。特定のアッセイのために、私たちはエメラルドグリーン（EMD）蛍光タンパク質10,11をコードするレトロウイルスの複製ベクター（RRV）でalloCTLを形質導入した。 OTH用ERSは、腫瘍細胞をmStrawberryをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。
alloCTLは、腫瘍細胞単層から回収した腫瘍細胞の単層またはECMのいずれかの中心にマニホールドのチャネルを介して播種した。接着性および非接着細胞の相互作用は、光によって、および/または経時的な蛍光顕微鏡によって可視化した。ハイパワーで断片化した核を有する低電力での腫瘍細胞の単層、または腫瘍細胞の混乱は、それぞれ、溶解およびアポトーシスによる細胞傷害の指標であった。我々は、デジタル的に、単層培養上の非付着性蛍光T細胞の遊走を示す表面強度の蛍光マップを作成した。我々はまた、細胞傷害性がオーバーレイ非接着alloCTLのクラスターを形成した後に接着性神経膠腫細胞の単層に生ん留意。同様に、神経膠腫の単分子層へalloCTLからRRV-EMDの水平伝達が観察された。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一細胞懸濁液中の腫瘍細胞を、テフロン（登録商標）マスクされたスライドのウェルにピペットで入れた。細胞が付着させ、次いで加湿した5％CO 2、37℃インキュベーター（ 図1A）で単層を形成した。単層から派生設立単層またはECMタンパク質は、これらのアッセイ（ 図1B）のために収穫することができた。 EMDをコードするベクターを用いて重要な蛍光色?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 CA121258、R01 CA125244、R01 CA154256、NIH / NCATS UCLA CTSIグラント番号UL1TR000124、USAMRMC W81XWH-08-1-0734、およびジョアンS.ホームズ記念研究基金によって部分的にサポートされている。 MJHとGCOはUCLAのジョアンS.ホームズ記念ポストドクトラルフェローシップからサポートされた。 www.creative-sci.com：CSM装置を創造科学的方法から得られた。レンチウイルスベクターは、CURE / P30のDK041301でサポートされているUCLAのベクトル·コア、から受信されました。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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