The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
교 아세포종 (GBM)은 가장 흔한 원발성 뇌종양이며 늘 치명적이다. 치료 화학 요법과 방사선 치료의 비 특정 표준과 함께 수술 적 절제에는이 병 1 명 적은 15 개월 실력 예후 결과, 악성 세포를 제거 할 수 없습니다. 대조적으로, 면역 요법은 특히 종양 세포를 표적으로하는 정확한 방법을 제공하고, 이에 부수적 인 독성 2-4의 위험 감소와 매우 효과적인 치료 플랫폼 역할을 할 가능성이있다. T 세포 항원 수용체 키메라 (자동차), 종양 면역을위한 다용도 전략을 제공 표현을 생체 공학적. 자동차 복잡한 전장 주요 조직 적합성 대신, 하나 이상의 세포 내 T 세포 신호 전달 분자 (들)과 항체의 세포 외 가변 영역을 융합시킴으로써 생성된다 (MHC)는 T 세포 수용체 5 -restricted. 항체와 같은 항원 인식 및 시상식이 모드반응성 항원 – 특이 T 세포는 MHC 인식의 부재하에 종양 항원에 반응 사실상 무한 항원 레퍼토리를 위해 적응 될 수있는 데에 대해 허용.
종양 항원에 대해 다양한 설계 CAR의 T 세포 병원 6-9 전임상 효능과 우수한 가능성을 보여 주었다. 구체적으로는, GBM의 맥락에서, CAR T 세포 플랫폼 타겟팅 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII)는, 종양 특이적인 변이는 세포 표면 (10) 상에 표현 된 신경 교종 – 함유 마우스 (11)의 생존 기간을 연장시키는 것으로보고되었다. 그 다양성에도 불구하고, CAR 대체 요법의 임상 적 이점은 완전히 인해 종양 – 관련 면역 억제 및 면역 회피 12-16뿐만 아니라 생체 내 (in vivo)에서 확립하는 항원 – 특이 T 세포를 유지하는 문제에 대한 부분적으로 실현되지 않았다. 면역 요법으로 치료 (SOC)의 표준을 활용하여 잠재적으로 이러한 리터의 몇 가지 극복 할 수있다모방, 모두 전임상 및 임상 설정에서 강화 된 효능의 결과.
후 절제 GBM에 대한 SOC는 고용량 테모 졸로 마이드 (TMZ), DNA 알킬화제 (17), 및 뇌 전체 조사 (WBI)로 구성 1. 이러한 치료는 종양 MHC 발현 18 ~ 20의 상향 조절과 죽은 종양 세포 17,19,21,22에 의해 항원의 흘림을 통해 종양 백신과 시너지 효과로 추정된다. 실제로, 임상 설정에서 면역 기반 치료의 향상된 항 종양 효능에 TMZ 20,23 또는 WBI 18,24 리드의 추가. 또한, 많은 비 특정 세포 독성 화학 요법처럼, TMZ는 대체 요법 플랫폼 27 ~ 29에 대한 호스트 조절의 수단으로 활용할 수있는 전신 림프구의 (25), (26)을 유발하는 것으로 알려져있다. TMZ 매개 lymphodepletion는 ADOP 효능의 증가로 이어지는, 항원 특이 적 T 세포의 주파수 및 기능을 향상시키는 것으로 밝혀졌다두개 내 종양 (30)에 대하여적인 치료 플랫폼입니다. CAR 요법의 맥락에서 lymphodepletion 모두 그러므로 항 종양 활성 11,34 향상 내인성 억제 T 세포 (31)의 수를 줄이고, 사이토 카인 (33)에 대해 감소 된 경쟁을 통해 항상성 확산 (32)을 유도함으로써 호스트 컨디셔닝 수단을 구성한다. SOC의 맥락에서 새로운 입양 치료 및 백신 플랫폼을 평가하는 효능에 대한 의미있는 결론을 도출 중요하다, GBM의 SOC 및 면역 요법 플랫폼 간의 상승 작용을 감안할 때.
이 프로토콜에서는 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 (처리 타임 라인에 대한도 1 참조) 마우스에서 TMZ 베어링과 함께 WBI 뮤린 EGFRvIII CAR에 특이 T 세포의 생성 및 정맥 내 투여를위한 방법을 설명합니다. 간략하게, CAR T 세포가 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 생체 외에서 이루어진다. 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포를 수확 및 병렬에서 배양되어 활성화 된 쥐의 비장 세포를 형질 도입하는 데 사용되는 바이러스를 생산하는 (CAR 벡터 및 PCL-에코 플라스미드를 포함) DNA / 지질 복합체를 이용하여 형질 전환된다. CAR 생성하는 과정에서 EGFRvIII 양성 두개 내 종양을 갖는 쥐의 호스트는 임상 SOC에 비해 용량으로 분류 된 전체 뇌의 X 선 조사 및 전신 TMZ 치료를 투여한다. CAR T 세포는 lymphodepleted 호스트로 정맥 내 전달된다.
다음 절차에 따라 7 개의 별개의 단계로 설명되어 담암, 담암 마우스의 (2) 전뇌 조사, 마우스, (3) 형질 감염 테모 졸로 마이드 (1) 관리, (4) 비장 절제술 및 T 세포의 제조, (5 종양 베어링 마우스에 (6) 자동차 T 세포 배양 및 수확하고, (7) 자동차 T 세포 관리) 형질 도입,. 이 단계 6-7 일에 걸쳐 동시에 수행되는 여러 단계로 구성되어 있습니다.
여기에 설명 된 처리 타임 라인은 치료의 임상 표준 모델 및 차량 대체 요법에 대한 효과를 활용하도록 설계되었습니다. CAR T 세포의 투여 량, TMZ 요법 및 방사선 요법 투여는 생체 내에서 T 세포 활성, lymphodepletion, 및 종양 사멸에 강화하도록 변형 될 수있다. TMZ 섭생 호스트 myeloablation 적응 적 전송 및 셀 (30)의 증가 된 팽창을 수득 증가 될 수있다. 따라서 SOC의 암세포 살상 특…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |