גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.
הייצור של חלבונים בממברנה רקומביננטי ללימודים מבניים ותפקודיים נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל רמות נמוכות של ביטוי וחוסר היציבות הטבועה של חלבונים בממברנה רבות solubilized פעם אחת בחומרי ניקוי. פרוטוקול מתואר המשלב שיבוט עצמאי קשירה של חלבונים בממברנה כשילובי GFP עם ביטוי בcoli Escherichia זוהה על ידי הקרינה GFP. זה מאפשר הקרנת הבנייה וביטוי חלבון קרום מרובה של / גרסאות לזהות מועמדים מתאימים להשקעה נוספת של זמן ומאמץ. כתב ה- GFP משמש במסך ראשי של ביטוי על ידי הדמיה הקרינה GFP הבא אלקטרופורזה SDS polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE). חלבוני קרום שמראים שתי רמת ביטוי גבוהה עם השפלה מינימום כפי שעולה מהעדר GFP החופשי, נבחרו למסך המשני. מבנים אלה הם מדורגים והכין כולל שבריר קרום וsolubilizeד בארבעה חומרי ניקוי שונים. בעקבות ultracentrifugation כדי להסיר חומר ניקוי-מסיס, lysates מנותחות כרומטוגרפיה גילוי הקרינה הדרת גודל (FSEC). ניטור פרופיל הדרת גודל על ידי הקרינה GFP מספק מידע על מונו-dispersity והשלמות של החלבונים בממברנה בחומרי ניקוי שונים. חלבון: שילובי חומרי ניקוי שelute עם שיא סימטרי עם GFP מעט או ללא תשלום וצבירת מינימום הם מועמדים לטיהור שלאחר מכן. שימוש במתודולוגיה לעיל, ביטוי Heterologous בE. coli של SED (צורה, התארכות, החלוקה, ונִבִיגָה) חלבונים מ -47 זנים שונים של חיידקים נותח. יש לי חלבונים אלה בדרך כלל עשרה תחומים הטרנסממברני וחיוניים לחלוקת תאים. התוצאות מראות כי הייצור של orthologues SEDs בE. coli היה משתנה מאוד ביחס לרמות הביטוי ושלמות של חלבוני היתוך GFP. אני הניסויdentified משנה לחקירה נוספת.
הערכה הוא כי חלבוני קרום מהווים כ 20-30% מהגנים המקודדים בכל הגנום רצף 1, כוללים את הגנום האנושי 2. בהתחשב בתפקידם הקריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, למשל תחבורה של מטבוליטים, דור אנרגיה וכמטרה לתרופות, יש עניין רב בקביעת המבנה התל ממדים שלהם. עם זאת בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני קרום מאוד בחלבון נתוני הבנק תחת הייצוג. למעשה, של 99624 המבנים שוחררו בPDB (http://www.rcsb.org/pdb/) רק 471 (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) מסווגים כחלבוני קרום. זה משקף את הקשיים הטכניים של עבודה עם חלבוני הקרום שבאים לידי ביטוי באופן טבעי ברמות נמוכות יחסית; רודופסין הוא אחד מכמה יוצאים מן הכלל 3,4. ביטוי יתר של גרסת רקומביננטי ים בתאי Heterologous לעתים קרובות תוצאות misfolding ומיקוד עניים הקרום המגביל את הרמה הכללית של ייצור. בחירת חומר הניקוי הטוב ביותר להפקה וsolubilization של חלבון קרום הביע פעם עושה טיהור שלאחר מכן קשה ודורשת אופטימיזציה זהירה.
coli Escherichia נשאר מארח הביטוי הנפוץ ביותר לחלבוני קרום והיוו 72% (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) של מבנים נפתרו עד היום שהם כמעט אך ורק ממקורות חיידקים. E. הספציפי זני coli, C41 (DE3) וC43 (DE3), היו מבודדים שאינו מובילים לביטוי היתר של חלבונים בממברנה ולכן להימנע מההשפעות של הרעילות נצפתה עבור BL21 אחר זני 5,6. כוונון רמת ביטוי חלבון קרום רקומביננטי נראה קריטי לייעול רמת הייצור 6,7.
<p class="Jove_content"> במקרים רבים ייצור מוצלח של חלבונים בממברנה לקביעת מבנה דרש ההערכה של מספר גרסאות כוללים amino- ומחיקות carboxy-מסוף, orthologues מרובה לנצל וריאציה רצף טבעית וחלבוני היתוך שונים 6-8. לכן, שיטה להקרנת הביטוי של חלבונים בממברנה מרובות במקביל היא חיונית. גישה אחת נפוץ היא למזג את החלבון לחלבון פלואורסצנטי ירוק ביטוי (GFP) המאפשר להיות במעקב ללא הצורך לטהר את החלבון. בדרך זו, מידע על רמת ביטוי, יציבות והתנהגות בחומרי ניקוי שונה ניתן להעריך עם כמויות קטנות של חומר מטוהר un 9-12.במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול יעיל לסינון שיבוט וביטוי של חלבונים בממברנה בE. coli באמצעות היתוך GFP ככתב של ייצור והאפיון הבא של חומרי ניקוי: comp חלבוןlexes (איור 1).
בפרוטוקול המתואר במאמר זה, שיבוט עצמאי קשירה לתוך וקטור כתב GFP הוא בשילוב עם גילוי הקרינה להקרין את הביטוי היחסי של חלבונים בממברנה המרובים במהירות E. coli. וקטורים יכולים להתבצע בארבעה ימי עבודה בהקרנת ביטוי ראשוני לוקחת שבוע נוסף. בג'ל הקרינה של lysates בחומרי ניקוי מכל תאים המשמשת לדירוג ביטוי פוגע לניתוח נוסף במסך המשני. מסך הביטוי העיקרי כפי שהוצג אינו דורש כל ציוד מומחה מלבד חממה ייקר מתאימה לגידול תאים בלוקים גם עמוקים. כל טיפול הנוזל האחר שקשור ללוחיות SBS 96-גם יכול להתבצע באמצעות טפטפות רבת-ערוצית. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לכלול זני coli אחרים E. גדלו בתנאים שונים ביטוי (למשל טמפרטורה נמוכה יותר). במקרה של LEMO21 (DE3) titrating רמת rhamnose (0-2.0 מ"מ)הוסיף לווסת את קצב השעתוק יכול להגדיל את רמת ביטוי של חלבונים מסוימים קרום 7. חומרי ניקוי אחרים מאשר DDM יכול לשמש להפקה במסך הראשי אם כי חומרי ניקוי חריפים יותר עשוי solubilize חלבוני מגופי הכללה ולכן נותנים תוצאות חיוביות שגויות. ברור, יותר לפרט המסך הראשוני הופך, יותר ניסוי הזמן רב.
המסך המשני כרוך בהכנת חלק קרום מוחלט מלהיטי הביטוי שזוהו במסך הראשי. זהו צעד קריטי כפי שיאשר את הלוקליזציה של חלבוני היתוך הקרום של E. תאי coli. החילוץ הבא של חלבון היתוך GFP בחומרי ניקוי שונה מנוטר על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל זוהה הקרינה של חומר solubilized להעריך את מונו-dispersity של מתחמי חומר ניקוי-חלבון. זהו עוד שלב קריטי שכן הוא מזהה את חומר הניקוי המתאים ביותר לsolubilization של חלבון הקרום לעיבוד במורד הזרם שלאחר מכן. עם זאת, ניסיון מראה כי אופטימיזציה נוספת של הבחירה של חומר ניקוי (ים) עדיין עשויה להידרש במהלך טיהור וגיבוש. ראיות להתנהגות אחידה בחומרי ניקוי שונים, כולל אלה עם גודל קטן יחסית micelle (למשל LDAO) נראית אינדיקטור טוב של נטייה ליצירת גם diffracting גבישים לפחות לחלבוני קרום פרוקריוטים 14. במובן זה הפרופיל מוצג לחלבון הקרום באיור 2 מופיע חיובי ביותר.
היתרון העיקרי של שימוש בכתב GFP הוא שזה נותן קריאה מתוך מהירה של ביטוי בדגימות המטוהר של האו"ם. חסרון הוא שחלבון היתוך GFP צריך להיות מוסר במהלך הטיהור של החלבון להתגבשות. במקרה של הווקטורים משמשים כאן, אתר פרוטאז rhinovirus 3C מאפשר מחשוף של GFP. לחלופין, זה פשוטמחדש שיבוט חלבוני מועמד, שזוהו במסך, לוקטורים שרק להוסיף polyhistidine או תג זיקה אחר לטיהור שלאחר מכן. זאת בהנחה שהיתוך GFP אין צורך לביטוי. התחליף העיקרי לשימוש בהיתוך GFP לגילוי של ביטוי חלבון הקרום וsolubilization הוא להוסיף רק תג היסטידין. עם זאת גישה זו בדרך כלל דורשת שמתחילה בשבריר קרום 15 שלהערכת גרסאות רבות היה להיות מאוד זמן רב.
לסיכום, המטרה העיקרית של הפרוטוקול המתואר במאמר זה היא לאפשר למספר גדול של רצף חלבון קרום גרסאות להיות מוערך במהירות במונחים של ביטוי וsolubilization חומרי הניקוי וסדר עדיפויות לניתוח מעמיק יותר.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |