简化的方法来筛选重组膜蛋白的基础上融合绿色荧光蛋白大肠杆菌表达呈现。
重组膜蛋白结构和功能研究的生产仍然在技术上具有挑战性的由于表达水平低,许多膜蛋白的固有的不稳定性,一旦溶解在洗涤剂。的协议描述,结合膜蛋白结扎独立克隆的GFP融合在了GFP荧光检测大肠杆菌表达。这使得多个膜蛋白的结构和表达筛选/变种,以找出适合的时间和精力进一步投资的候选人。 GFP报告是由可视化的GFP荧光下列SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用在表达的一个主屏幕。膜蛋白,显示都与最小退化高表达水平由于缺乏自由绿色荧光蛋白的所指示的,被选择为辅助屏幕。这些构建体被定标和一个总的膜级分制备和增溶D在四种不同的洗涤剂。以下超速离心以除去去污剂不溶性材料,裂解物通过荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)分析。监控尺寸排阻轮廓通过GFP荧光提供了关于在不同洗涤剂的膜蛋白的单分散度和完整性信息。蛋白质:与一个对称峰具有很少或没有自由GFP和最小聚合洗脱洗涤剂组合候选为随后的纯化。使用上述方法,所述的异源表达在大肠杆菌中的SED(形状,伸长,除法和孢子)从47个不同种类的细菌蛋白质的大肠杆菌进行了分析。这些蛋白质通常具有10个跨膜结构域,并且是细胞分裂至关重要。结果表明,生产的在大肠杆菌中的直向同源物的SED 大肠杆菌是用GFP融合蛋白的相对表达水平和完整性高度可变。实验我dentified进一步调查的一个子集。
据估计,膜蛋白占编码所有测序的基因组1,包括人类基因组2的基因的约20-30%。定在许多生物过程的关键作用,对于代谢产物,能产生例如运输和作为药物靶标,存在在确定其三维结构的强烈兴趣。然而相比可溶性蛋白,膜蛋白是高度低于限额在蛋白质数据库。在99624释放结构在PDB(在实际上, http://www.rcsb.org/pdb/ )只有471( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ )被分类为膜蛋白。这反映了与它们天然表达在相对低的水平的膜蛋白加工的技术困难;视紫红质是少数例外3,4之一。过度表达的重组版本S IN的异源细胞经常导致错误折叠和差的定位,以限制了生产的总体水平膜上。选择用于提取膜蛋白和溶解的最佳洗涤剂一旦表达使得随后的纯化困难并且需要仔细的优化。
大肠杆菌仍然是膜蛋白占72%(最常用的表达宿主http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/结构)解决迄今这是几乎全部来自细菌来源。具体E.大肠杆菌菌株,C41(DE3)和C43(DE3)中,已分离出不导致过度表达膜蛋白,从而避免毒性观察其他BL21菌株5,6的影响。调谐重组膜蛋白表达的水平似乎是优化生产6,7的水平是至关重要的。
<p class=“jove_content”>在许多情况下,成功地生产膜蛋白用于结构确定的已要求的多个版本包括氨基和羧基末端缺失,多重直向同源物利用天然序列变异和不同的融合蛋白6-8的评价。因此,对于多个膜蛋白平行的表达筛选的方法是至关重要的。一种常用的方法是将融合蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)使表达,而不需要纯化蛋白进行跟踪。以这种方式,关于表达量,稳定性和行为在不同洗涤剂信息可与少量的未纯化的材料9-12中进行评估。在这篇文章中,我们描述了一个精简的协议膜蛋白在大肠杆菌中克隆和表达筛选利用大肠杆菌融合到GFP的生产和洗涤剂随后表征记者:蛋白质补偿LEXES( 图1)。
在这篇文章中描述的协议,结扎独立克隆到GFP报告载体是结合荧光检测来快速筛选在大肠杆菌中的多个膜蛋白的相对表达大肠杆菌 。向量可以在四个工作日内与主要表达筛选采取进一步的一周进行。在凝胶全细胞裂解物的洗涤剂的荧光被用来排名命中表达进行进一步的分析中的二次屏幕。作为呈现的主要表达屏幕不需要任何专门设备除了适用于深井块生长细胞摇床培养箱。所有其他液体处理涉及的96孔平板的SBS可以使用多通道移液器进行。该协议可以很容易地修改,以包括不同的表达的条件( 例如较低的温度)下生长的其他大肠杆菌菌株。在LEMO21(DE3)中的情况下,滴定鼠李的水平(从0至2.0毫摩尔)加到调节转录的速率可以增加一些膜蛋白7的表达水平。洗涤剂比DDM其它可用于提取在主屏幕虽然苛刻洗涤剂会从包涵体溶解蛋白质,因此给予误报。显然,更详细说明的初始画面变得越费时的实验。
次级屏幕涉及制备从在初级筛选中鉴定的表达命中一个总的膜级分。这是一个关键步骤,因为这将证实该融合蛋白的定位,以大肠杆菌的膜大肠杆菌细胞。的GFP融合蛋白在不同洗涤剂随后提取通过荧光检测到的大小排阻溶化材料的色谱监测,以评估单分散度洗涤剂 – 蛋白质复合物的。这又是一个关键的一步,因为它确定最合适的洗涤剂增溶的膜蛋白进行随后的下游加工。然而,经验表明,可能仍纯化和结晶期间被要求的洗涤剂(多个)的选择的进一步优化。在不同的去污剂包括那些具有相对较小胶束粒度( 例如 LDAO)均匀行为证据似乎是一种倾向,以形成良好的晶体衍射至少为原核生物膜蛋白14的良好指标。在这方面示出用于图2B中的膜蛋白的轮廓似乎非常有利。
使用GFP报告的主要优点是,它提供了快速读出表达的未纯化的样品中。一个缺点是,在GFP融合蛋白具有的蛋白质进行结晶的纯化过程中被除去。在这里使用的载体的情况下,一个鼻病毒3C蛋白酶位点使GFP的裂解。可替代地,它是直接重新克隆候选蛋白,在筛选中鉴定,到载体中仅添加一个聚组氨酸或其它亲和标记为随后的纯化。这假定融合到绿色荧光蛋白是没有必要的表达。主替代使用融合到绿色荧光蛋白检测膜蛋白表达和增溶的是只添加组氨酸标签。然而,这种方法通常需要开始一个膜部分15,它为许多变体的评价将变得非常费时。
总之,本文中描述的协议的主要目的是使大量的膜蛋白序列的变体可以迅速地评价在表达和洗涤剂增溶的术语和优先进行更深入的分析。
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |