Простой метод ДНК флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизация, чтобы раздавил хромосом
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Этот подход особенно эффективен при картографических высоко повторяющихся последовательностей в гетерохроматических регионах, где вычислительные подходы сталкиваются с непреодолимыми трудностями. Здесь мы опишем обтекаемый протокол для ДНК ISH, что обходит формамида моет, которые являются стандартными шаги в других протоколах ДНК ISH. Наш протокол оптимизирован для гибридизации с зондами коротких одиночных нитей ДНК, которые несут флуоресцентные красители, которые эффективно отмечают повторяющиеся последовательности ДНК в пределах гетерохроматических участков хромосом в целом ряде различных типов насекомых ткани. Тем не менее, приложения могут быть расширены для использования с большими зондов и визуализации последовательностей одна копия (не повторяющихся) ДНК. Мы демонстрируем этот метод отображения нескольких различных повторяющихся последовательностей раздавленных хромосом дрозофилы нервные клетки и Nasoniavitripennis сперматоциты. Мы показываем образцы гибридизации как для небольших, коммерчески синтезируемых зондов и для большого зонда для сравнения. Эта процедура использует простые лабораторные принадлежности и реагенты, и идеально подходит для исследователей, которые имеют небольшой опыт работы с выполнением ДНК ISH.
Introduction
ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Зондов для отдельных регионов копию в эухроматином могут быть получены через нескольких подходов, в том числе ник-трансляции или в конце маркировки сортового проката ДНК 1,2 и включение deoxygenin (DIG) -attached нуклеотидов и их признания в рамках широкого спектра Группа-сопряженных антитела 1-3. Визуализация эухроматиновых последовательностей в нескольких или одного числа копий требует использования либо один большой зондов с высокой удельной активностью или коктейль из нескольких меньших зондов, которые в совокупности повышают сигнал.
В отличие от этого, часто повторяющихся последовательностей, обнаруженных в гетерохроматина, такие как спутниковые ДНК, являются легкой мишенью для ДНК ISH, потому что они нормально существовать как десятки и тысячи повторов, сгруппированных в отдельных регионах хромосом называются блоками. Мобильных элементов может бытьнайти в большом числе копий на отдельных хромосомные локусы 2. В этих случаях, одиночные датчики с низкой удельной активностью могут эффективно маркировать гетерохроматиновые последовательности из-за их гибридизации в нескольких местах. Зонды для повторяющихся последовательностей могут быть синтезированы в продаже в виде коротких олигонуклеотидов (30-50 п.н.) и химически конъюгированный с любым из нескольких различных флуоресцентных групп. Отображение повторяющихся последовательностей внутри гетерохроматина с помощью генома секвенирования технологий затруднено из-за проблем, возникших в здании лесов на территории очень повторяющихся спутниковых блоков 4-6,7. В настоящее время ISH выступает в качестве наиболее эффективного способа отображения этих последовательностей на уровне суб-хромосомы. Эта стратегия имеет важное значение для отображения большого числа повторяющихся последовательностей, которые вскрываются в текущих генома и транскриптомный секвенирования исследований.
Эффективность и простота отображения повторяющихся последовательностей на слайд-смонтирован хромосом будет GREатлы усиливается упрощенной протокола ДНК ISH. Например, существующие протоколы для ДНК ISH включать в себя несколько стирок гибридизован- тканей в формамиде решения 2,8, добавляя тем самым существенный вклад в нужном для последовательностей отображения, а также получения больших количеств химических отходов этой дорогостоящей реагента. Здесь мы опишем пересмотренный метод ДНК ISH, что обходит необходимость формамидных моет и использует основную лабораторного оборудования и реагентов. Этот метод был первоначально разработан для быстрого отображения часто повторяющимися последовательностями ДНК в гетерохроматине дрозофилы личинок нейробластах с помощью коммерчески синтезируемых олигонуклеотидов, которые сопряженные с флуоресценции красителей. Тем не менее, этот способ также работает для отображения повторяющихся последовательностей с помощью более крупных зондов, синтезированных с помощью других средств 9,10 и через нескольких различных тканей и хромосомных типов. Кроме того, этот метод может быть использован для отображения эухроматиновые последовательности, используя больше или мнле, коротких зондов в пределах эухроматиновые интерес последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
ДНК ISH часто используется для отображения специфических последовательностей в хромосомах. Мы описали простой метод ДНК ISH оптимизированный для большое количество копий, гетерохроматических последовательностей. Вместо того чтобы использовать для промывки в растворе формамида, котор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
