Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em> In-situ-</em> Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv bei der Kartierung hoch repetitive Sequenzen an heterochromatischen Regionen, in denen Rechenansätze gegen prohibitiv Herausforderungen. Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für DNA ISH, die Formamid wäscht die Standardschritte in anderen DNA ISH Protokolle umgeht. Unser Protokoll zur Hybridisierung mit kurzen Einzelstrang-DNA-Sonden, die Fluoreszenzfarbstoffe, die effektiv zu markieren repetitive DNA-Sequenzen in hetero chromosomalen Regionen in einer Anzahl verschiedener Insektengewebetypen durch optimiert. Jedoch können Anwendungen erweitert werden, um mit größeren Sonden und Visualisierung von Einzelkopie (nicht-wiederkehrende) DNA-Sequenzen zu verwenden. Wir zeigen, diese Methode durch die Abbildung verschiedene repetitive Sequenzen zu gequetscht Chromosomen von Drosophila melanogaster Nervenzellen und Nasoniavitripennis Spermatozyten. Wir zeigen Hybridisierungsmuster für beide klein, kommerziell synthetisiert Sonden und für eine größere Sonde zum Vergleich. Bei diesem Verfahren wird einfach Laborbedarf und Reagenzien, und ist ideal für Ermittler, die wenig Erfahrung mit der Durchführung DNA ISH haben.
Introduction
DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Sonden an einzelne Kopie Regionen innerhalb Euchromatin kann durch eine Handvoll von Ansätzen, darunter Nick-Translation oder Endmarkierung langer DNA-Produkte 1,2 und den Einbau von deoxygenin (DIG) -attached Nukleotide und ihre Anerkennung durch eine Vielzahl von erzeugt werden Gruppe-konjugierte Antikörper 1-3. Visualisierung der euchromatischen Sequenzen in wenigen oder einzelnen Kopienzahl erfordert die Verwendung von entweder einzelne große Sonden mit hoher spezifischer Aktivität oder einen Cocktail aus mehreren, kleineren Sonden, die gemeinsam zu verbessern Signal.
Im Gegensatz dazu hoch repetitive Sequenzen in heterochromatin gefunden, wie Satelliten-DNAs, sind leichter Ziele für DNA ISH weil sie existieren normalerweise als zehn bis Tausende von Wiederholungen im einzelnen Chromosomenregionen als Blöcke bekannt geclustert. Transposons können auchbei hohen Kopienzahlen an bestimmten chromosomalen Loci 2 gefunden. In diesen Fällen können einzelne Sonden mit geringer spezifischer Aktivität effektiv beschriften hetero Sequenzen aufgrund ihrer Hybridisierung an mehreren Standorten. Sonden an repetitive Sequenzen können im Handel als kurze Oligonukleotide (30-50 bp) synthetisiert und mit einer der mehreren verschiedenen fluoreszierenden Gruppen chemisch konjugiert. Mapping repetitiven Sequenzen im Heterochromatin durch Verwendung genom Sequenziertechnologien ist schwierig aufgrund der Herausforderungen im Gebäude Gerüste in stark repetitiven Satelliten Blöcke 4-6,7 gestoßen. Derzeit steht ISH als die effektivste Möglichkeit, die Zuordnung dieser Sequenzen am Unterchromosomenebene. Diese Strategie ist wichtig für die Zuordnung einer großen Anzahl von repetitiven Sequenzen, die von laufenden Genom und Transkriptom-Sequenzierung Studien aufgedeckt werden.
Die Effizienz und einfache Zuordnung repetitiven Sequenzen auf Objektträger angebrachten Chromosomen würde gre werdenatly durch ein vereinfachtes Protokoll für DNA ISH verbessert. So können bereits vorhandene Protokolle für DNA ISH beinhalten mehrere Wäschen hybridisiert Gewebe in Formamid-Lösung 2,8, somit im wesentlichen auf die erforderliche Zeit für die Zuordnung von Sequenzen hinzufügen und auch große Mengen chemischen Abfalls für diese teuren Reagenz. Hier beschreiben wir eine geänderte DNA ISH Verfahren, das die Notwendigkeit für Formamid Wäschen umgeht und setzt grundlegende Laborgeräten und Reagenzien. Dieses Verfahren wurde ursprünglich für die rasche Kartierung hoch repetitive DNA-Sequenzen in heterochromatischen Regionen Drosophila Larvenneuroblasten mit handels synthetisierte Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind entworfen. Allerdings funktioniert diese Methode auch für die Abbildung repetitiven Sequenzen durch den Einsatz größerer Sonden durch andere Mittel 9,10 und über mehrere verschiedene Gewebe und Chromosomentypen synthetisiert. Zusätzlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um euchromatic Sequenzen mithilfe länger oder multip abzubildenle, kurze Sonden innerhalb der euchromatischen Sequenz von Interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA ISH wird häufig verwendet, um spezifische Sequenzen auf Chromosomen kartieren. Wir haben ein einfaches Verfahren zur DNA ISH für hohe Kopienzahl, hetero Sequenzen optimiert beschrieben. Anstatt mit Waschungen in einem Formamid-Lösung, die eine Anforderung in anderen vorhandenen DNA ISH Protokolle ist, legen wir gewebe Dias direkt auf einen vorgeheizten Block an DNA zu denaturieren. Dieses Verfahren umgeht die Verwendung von großen Mengen an Formamid. Ein wichtiger Schritt für die Herstellung von klaren Hybridis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
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