The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Нервно-мышечного соединения (НМС) является большой, холинергическая реле синапс, через который млекопитающих моторные нейроны контролировать добровольное сокращение мышц. Структурные изменения в НМС может привести к поломке нервам, в результате слабости, атрофии и даже смерти мышечного волокна. Многие исследования изучали, как генетические изменения или болезнь может привести к изменению структуры НМС мыши. К сожалению, это может быть трудно непосредственно сравнивать результаты этих исследований, так как они часто используют различные параметры и аналитические методы. Три протокола описаны здесь. Первый использует Проекция максимальной интенсивности конфокальных изображений для измерения площади рецептора ацетилхолина (AChR) обогащенный постсинаптической мембраны доменов на концевой шайбы и области синаптической окрашивания пузырьков в вышележащей пресинаптических окончаний нервов. Второй протокол сравнивает относительные интенсивности иммунного окрашивания для синаптических белков в постсинаптической мембране. Третий прotocol использует флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET), чтобы обнаружить изменения в упаковке постсинаптических АХР на торцевой пластины. Протоколы были разработаны и уточнены в течение ряда исследований. Факторы, влияющие на качество и согласованность результатов обсуждаются и нормативные данные предоставляются НМС в здоровых молодых взрослых мышей.
Нервно-мышечном соединении (НМС) является критическим реле синапсов, что опосредует связь между нервной системы и скелетных мышцах. Это требуется для всех произвольных движений. Флуоресцентная микроскопия уже давно используется для изучения влияния трансгенов на мышь NMJ 1-3 или сравнить эффекты от возраста, диеты, физические упражнения и болезни на грызунов NMJs 4-11. Такие исследования научили нас много о физиологии и патофизиологии НМС, но различные параметры сообщалось (например, AChR площадь, Концевая пластина площадь, длина периметра, индексы фрагментации) часто затрудняют сравнение результатов этих исследований. Существует растущая ожидание доклинические исследователи, чтобы иметь возможность продемонстрировать воспроизводимость, в частности, в исследованиях с грызунами моделей болезни 12. Протоколы, описанные здесь, были уточнены в ходе ряда исследований, которая расследовала развития, физиологических и патофизиологических чАнгелов в НМС. Такие исследования требуют измерения области синаптических специализаций на двигателе мыши концевой пластинки и относительной плотности упаковки синаптических белков в постсинаптической специализаций 13-15.
Полезность этих методов свидетельствуют недавние исследования в мышиной модели анти-мускуса миастения. Ежедневные инъекции IgG из анти-мускусный положительного миастения пациентов в взрослых мышей заставило их стать слабыми в течение 2 недель 16. Конфокальные максимальной проекции изображения мышечных разделов, которые были дважды мечеными для синаптофизина (в нервных терминалов) и постсинаптических АХР показали прогрессирующее снижение в области АХР окрашивания в качестве основного изменений. Важно темпы снижения было достаточно, чтобы объяснить, сопоставимые снижение амплитуды синаптических потенциалов, отказ от синаптической передачи и мышечной слабости 17,18. Качественно аналогичные результаты были получены и другими исследовательскими группами10,19. Те же НМС методы измерения, поскольку были использованы для оценки влияния трех препаратов для лечения анти-мускуса миастения в этой модели мыши 20,21.
Сидячий старение может привести к потере нервно-мышечных соединений. Протоколы, описанные здесь, выявили снижение, связанное с возрастом в области нервных окончаний синаптофизина на двигателе концевых пластинок, как у мышей прогресс в пожилом возрасте. Те же методы показали, что добровольным мероприятием можно в значительной степени предотвратить уменьшение площади 22 терминала пресинаптических нервных, в соответствии с предыдущей работой со стороны других групп 4. Потеря нервно-мышечных соединений также происходит в модели SOD1G93A мыши бокового амиотрофического склероза 9,23.
Исследования, упомянутые выше, показывают, что многие факторы здоровья могут привести к сокращению в области либо до или после синаптических специализаций НМС. Это может привести к нарушению синаптической удовольствияие или может предвещать полную потерю нервно-мышечного соединения. Три протокола описан, что позволит количественно оценивать площади и плотности синаптических специализаций. Цель первого протокола является создание практического и воспроизводимое измерение области до и после синаптических специализации и их выравнивание при НМС млекопитающих, с помощью флуоресцентной микроскопии. Двумерные максимальной проекцией конфокальной изображения и анализа изображений с NIH ImageJ используется для обнаружения изменений в области синаптофизин окрашивания (синаптические пузырьки), постсинаптических АХР и синаптической области перекрытия. Конфокальные параметры визуализации (усиление и смещение уровня) оптимизированы для каждого НМС так, чтобы максимизировать визуальную информацию, используемую для разглядеть площадь синаптической специализации. Нервно ошибка может также возникнуть в результате изменений в плотности постсинаптических AChR и / или других синаптических белков. Второй протокол может быть применен для обнаружения изменений в относительной плотности постсинаптических белков, такихкак мускус, rapsyn, Dystroglycan, фосфорилированного Src киназы и фосфорилирования AChR 18,21.
В миастения, снижение плотности АЧР в постсинаптической мембране Непосредственной причиной синаптической недостаточности и мышечной слабости. Третий протокол описывает метод флуоресцентного резонанса Передача энергии (FRET), чтобы оценить изменения в непосредственной близости от соседних АХР в постсинаптических мембранах 14,15. Этот метод определяет передачу энергии между соседними АХР, меченных флуоресцентной-α-бунгаротоксина (BGT). FRET происходит только тогда, когда флуоресцентные донорные и акцепторные зонды менее 10 нм друг от друга. Это может выявить (субмикроскопические) изменения в герметичности АХР упаковки, которые могут непосредственно связанные с амплитудой синаптических потенциалов.
Эти три протокола, совершенствуется на протяжении последнего десятилетия, обеспечивают дополнительные меры NMJ целостности в последовательной и воспроизводимой образом. Использование стандартных протоколов Ай параметры должны облегчить сравнение эффектов генов и окружающей среды вмешательств на млекопитающих НМС.
Протоколы, описанные здесь, позволили нам надежно измерять и количественной оценки изменений в свойствах НМС по целому ряду условий, в том числе нормального старения и болезненных состояний. Методы, описанные в фас НМС изображения позволит исследователям сравнить площадь до и постсин…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
Zeiss | LSM 510 Meta | ||
Leica | SPE-II | ||
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |