De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de grote, cholinerge relais synaps waardoor zoogdieren motorische neuronen controle vrijwillige spiersamentrekking. Structurele veranderingen op de NMJ kan resulteren in neurotransmissie falen, wat resulteert in zwakheid, atrofie en zelfs de dood van de spiervezels. Vele studies hebben onderzocht hoe genetische modificaties of aandoening de structuur van de muis NMJ kan veranderen. Helaas kan het moeilijk zijn direct vergelijken resultaten van deze studies, omdat ze vaak gebruikt verschillende parameters en analysemethoden. Drie protocollen worden hier beschreven. De eerste maakt gebruik van maximale intensiteit projectie confocale beelden op het gebied van acetylcholine receptor (AChR) te meten rijke postsynaptische membraan domeinen bij de eindplaat en het gebied van de synaptische blaasjes kleuring in de bovenliggende presynaptische zenuwuiteinde. Het tweede protocol vergelijkt de relatieve intensiteiten van immuunkleuring voor synaptische eiwitten in het postsynaptische membraan. De derde protocol gebruikt Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) veranderingen in de verpakking van postsynaptische AChRs aan de eindplaat detecteren. De protocollen zijn ontwikkeld en verfijnd over een reeks van studies. Factoren die de kwaliteit en de consistentie van de resultaten beïnvloeden worden besproken en normatieve gegevens zijn bedoeld voor NMJs bij gezonde jonge volwassen muizen.
Introduction
De neuromusculaire junctie (NMJ) is de kritische relais synaps dat de communicatie tussen het zenuwstelsel en de skeletspieren bemiddelt. Het is vereist voor alle vrijwillige beweging. Fluorescentie microscopie al lang gebruikt om de effecten van transgenen bestuderen op muis NMJ 1-3 of de effecten van leeftijd, dieet, lichaamsbeweging en ziekte vergelijk bij knaagdieren NMJs 4-11. Dergelijke studies hebben ons veel geleerd over de fysiologie en pathofysiologie van de NMJ, maar de diverse parameters gerapporteerd (bv AChR gebied, eindplaat oppervlakte, omtrek lengte, fragmentatie indices) maken het vaak moeilijk om de resultaten van deze studies te vergelijken. Er is een toenemende verwachting voor preklinische onderzoekers kunnen reproduceerbaar zijn, vooral in studies met diermodellen voor ziekten 12. De hier beschreven protocollen werden verfijnd door een reeks studies die ontwikkeling, fysiologie en pathofysiologische ch onderzochtanges naar de NMJ. Dergelijke studies vereisen meting van het gebied van de synaptische specialisaties op de muis motorische eindplaat en de relatieve dichtheid van de verpakking van synaptische eiwitten binnen postsynaptische specialisaties 13-15.
De bruikbaarheid van deze methode wordt geïllustreerd door recente studies in een muismodel van anti-MuSK myasthenia gravis. Dagelijkse injecties van IgG uit anti-MuSK-positieve myasthenia gravis patiënten in volwassen muizen zorgde ervoor dat ze zwak worden binnen 2 weken 16. Confocale maximale projectie beelden spier secties werden dubbel gelabeld voor synaptofysine (in zenuw-terminals) en postsynaptische AChRs toonde een geleidelijke afname van het gebied van AChR kleuring als primaire verandering. Belangrijk is het tempo van de daling was voldoende om vergelijkbare dalingen in de amplitude van synaptische potentialen, falen van synaptische transmissie en spierzwakte 17,18 verklaren. Kwalitatief vergelijkbaar bevindingen werden gerapporteerd door andere onderzoeksgroepen10,19. Dezelfde NMJ meetmethoden zijn sindsdien gebruikt om het effect van drie geneesmiddelen te beoordelen voor het behandelen van anti-MuSK myasthenia gravis in dit muismodel 20,21.
Sedentaire veroudering kan leiden tot verlies van de neuromusculaire verbindingen. De hier beschreven protocollen hebben een leeftijdsgebonden achteruitgang op het gebied van zenuwuiteinde synaptofysine bij motorische eindplaten geopenbaard als muizen vooruitgang tot op hoge leeftijd. Dezelfde methoden bleek dat vrijwillige uitoefening grotendeels kon voorkomen dat de vermindering van de presynaptische zenuwuiteinde gebied 22, in overeenstemming met eerder werk van andere groepen 4. Verlies van neuromusculaire verbindingen komt ook voor in de SOD1G93A muismodel van amyotrofische lateraal sclerose 9,23.
De bovengenoemde studies tonen aan dat een verscheidenheid van gezondheidsproblemen kan leiden tot vermindering van het gebied van een van beide pre- of post-synaptische specialisaties op het NMJ. Dit kan resulteren in een verminderde synaptische functie of kunnen inluiden volledig verlies van de neuromusculaire verbinding. Drie protocollen worden beschreven dat kwantificering van het gebied en de dichtheid van synaptische specialisaties mogelijk te maken. Het doel van het eerste protocol is een praktische en reproduceerbare meting van de oppervlakken van pre- en postsynaptische specialisaties en hun aanpassing aan zoogdieren NMJs indienen waarbij fluorescentiemicroscopie. Tweedimensionale maximum projectie confocale beelden en beeldanalyse met NIH ImageJ om wijzigingen in het gebied van synaptophysine kleuring (synaptische blaasjes), postsynaptische AChRs en synaptische overlappingsgebied detecteren. Confocale beeldvorming parameters (gain en offset niveau) worden geoptimaliseerd voor elke NMJ om de visuele informatie gebruikt om het gebied van synaptische specialisatie onderscheiden maximaliseren. Neuromusculaire mislukking kan ook resulteren uit veranderingen in de dichtheid van postsynaptische AChR en / of andere synaptische eiwitten. Het tweede protocol kan worden toegepast om de veranderingen in de relatieve dichtheid van postsynaptische eiwitten detecterenals muskus, rapsyne, dystroglycan, gefosforyleerd Src kinase en gefosforyleerd AChR 18,21.
In gravis myasthenie, een verminderde dichtheid van AChR binnen de postsynaptische membraan is de directe oorzaak van synaptische mislukking en spierzwakte. Het derde protocol beschrijft een Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) gebruikt om veranderingen in de nabijheid van aangrenzende AChRs op postsynaptische membranen 14,15 beoordelen. Deze methode detecteert energieoverdracht tussen naburige AChRs gelabeld met fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET alleen gebeurt wanneer de fluorescerende donor en acceptor probes minder dan 10 nm uit elkaar. Dit kan (submicroscopic) veranderingen in de dichtheid van AChR verpakking die rechtstreeks betrekking kunnen hebben op de amplitude van synaptische potentialen onthullen.
Deze drie protocollen, verfijnd in het afgelopen decennium, bieden aanvullende maatregelen van NMJ integriteit op een consistente en reproduceerbare wijze. Het gebruik van gestandaardiseerde protocollen eennd parameters dienen vergelijking van de effecten van genen en milieu-ingrepen op het zoogdier NMJ vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocollen hebben ons in staat om betrouwbaar te meten en te kwantificeren veranderingen in de eigenschappen van de NMJ in een heel scala van voorwaarden, met inbegrip van de normale veroudering en de ziekte van staten. De beschreven voor en methoden geconfronteerd NMJ beelden kunnen de onderzoekers het gebied van pre- en postsynaptische specialisaties en het gebied van de synaptische overlap / uitlijning te vergelijken. Het vergelijken van de relatieve intensiteit van pre- en postsynaptische eiwitte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
References
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
- Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
- Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
- Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
- Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
- Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
- Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
- Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
- Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
- Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
- Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
- Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
- Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
- Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
- Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. , (2004).
- Chiasson, R. B. . Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
- Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
- Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
- Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
- Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
- Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
- Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
