En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados y demostraron.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse en microscopía vivo en organismos intactos permite la visualización directa de los procesos biológicos complejos que son inaccesibles para el análisis tradicional punto de una sola vez, como la inmunohistoquímica. Específicamente, la microscopía de múltiples fotones (MPM) 1 permite la formación de imágenes en la dispersión de tejido, tal como el neocórtex roedor, donde se ha logrado de formación de imágenes hasta 2,3 y en exceso de 4 1 mm. Cuando se combina con las preparaciones quirúrgicas 5-7 en los que un procedimiento permite acceso óptico al cerebro durante semanas a meses, estos enfoques de microscopía se han utilizado para estudiar los procesos dinámicos en el cerebro en estados sanos y enfermos 8-11. Además, los protocolos se han desarrollado 12,13 que proporcionan para formación de imágenes in vivo en animales despiertos (es decir, no anestesiados), lo que permite la imagen funcional celular resolución durante ensayos de comportamiento. Estos protocolos se han utilizado para Comparisons de correlacionado la actividad neuronal 14, calcio astrocito señalización 15 en animales anestesiados y despiertos, la identificación de los grupos neuronales específicos de la tarea 16, y la capacidad de las neuronas para discriminar la localización de objetos a la estimulación de la barba 17.
Dado el potencial de este enfoque para elucidar los mecanismos sanos y patológicos, de lapso de tiempo de imágenes in vivo se aplicó a la médula espinal de ratón (SC), lo que permite la identificación de la degeneración axonal aguda (AAD) como un mecanismo de la enfermedad 18. Estudios posteriores efectos de las lesiones periféricos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) axón de regeneración 19, el papel de los vasos sanguíneos en la regeneración de axones 20, quimiotaxis glial en respuesta a la lesión 21, la migración de células T en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 22, la actividad investigados de la microglia y astrocitos 23,24 25 en respuesta a amyotrophesclerosis ic lateral (ALS), el papel de STAT-3 en crecimiento axonal después de la lesión SC (SCI) 26, y un mecanismo de pérdida de axón y recuperación de la EAE 27. A pesar del éxito de estos enfoques, todos estos estudios se limitaron a ya sea una sola sesión de imágenes, limitando así los estudios de dinámica de corto plazo, o de lo requerido repetida aberturas quirúrgicas de los animales en cada punto de tiempo de formación de imágenes, limitando el número de puntos de tiempo accesibles y el aumento de la probabilidad de artefactos experimentales de confusión. Los protocolos para estas cirugías han sido publicados anteriormente 28,29.
Recientemente, publicamos una técnica 30 para la implantación de una cámara de médula crónica que permitió time-lapse de imágenes MPM en el SC ratón sobre varias semanas sin necesidad de reintervenciones. Brevemente, esta preparación quirúrgica incluyó la realización de la laminectomía en la columna torácica inferior y la implantación de una cámara de cuatro partes. La cámara incluyetres piezas a medida mecanizadas de acero inoxidable que se ligan las vértebras que rodea la laminectomía y un cubreobjetos de vidrio colocada sobre el SC y asegurado con elastómero de silicona. Esta técnica permitió la proyección de imagen de rutina a más de 5 semanas de la operación en los estados sanos y heridos sin la necesidad de reintervenciones. El número de puntos de tiempo de formación de imágenes se limita solamente por la frecuencia a la que el animal puede tolerar la inducción anestésica. Curso de la vida Imaging estaba limitado por el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie de la SC. Además, hemos comprobado que el implante quirúrgico no tuvo ningún efecto a largo plazo sobre la función motora.
Desde nuestra publicación inicial, los enfoques alternativos que permitan también la imagen a largo plazo en el SC se han descrito en otra parte 31-33. Este protocolo demuestra nuestro procedimiento para la implantación de la cámara de la médula desarrollamos.
La técnica ha demostrado aquí permite repetida, lapso de tiempo, las imágenes en vivo del ratón dorsal SC a muchas semanas después de la operación sin necesidad de procedimientos quirúrgicos posteriores. Este procedimiento representa una mejora sustancial sobre los estudios de imagen de repetición de la cirugía o más de los enfoques histológicos portmortem, donde se pierde la información sobre la dinámica celular. Tenemos previamente 30 demostraron el valor de esta técnica para el estudio de la patología SCI en vivo.
La extensión longitudinal máxima de formación de imágenes se determinó mediante el crecimiento de un tejido denso y fibroso sobre la superficie dorsal de la SC. Con el tiempo, este crecimiento resultó en la pérdida de contraste y resolución de imagen. Este crecimiento también se ha visto en las preparaciones quirúrgicas alternativas 31. Anecdóticamente, hemos observado que este crecimiento puede ser minimizado mediante el lavado cuidadosamente la superficie dorsal SC para eliminar productos de la sangre, el sellado de la superficie deel hueso cortado con cianoacrilato, sellando los bordes de la cámara de bien con elastómero de silicona, y minimizando el espacio intersticial entre el SC dorsal y el vidrio de cubierta.
Recientemente, otro enfoque similar a nuestro propio uso de una cámara de policarbonato se ha demostrado 32. El uso de policarbonato es ventajoso puesto que es compatible con rayos X y las modalidades de formación de imágenes acústicas, que no es el caso para nuestras piezas de acero inoxidable. Sin embargo, con la tecnología ahora ubicua de las impresoras 3D, partes de la cámara se pueden fabricar a partir de una amplia variedad de materiales para adaptarse a necesidades específicas. Hemos impreso recientemente todas nuestras partes en un fotopolímero clara.
Una desventaja clave de una cámara cerrada es la incapacidad para administrar dosis repetidas de drogas o colorantes exógenos adecuados para la formación de imágenes 34 SC. Sin embargo, mediante la capitalización de la estabilidad mecánica de nuestro sistema actual, ya hemos utilizado nuestra cámara presente para el éxitoLy anclar un catéter intratecal conectado a un puerto de inyección implantado subcutáneamente, lo que permitió la administración de fármacos en múltiples puntos de tiempo incluso en un sistema de cámara cerrada (trabajo no publicado). Además, debido a la naturaleza modular de la placa superior, las futuras versiones de esta preparación se incluir una cámara de resellable para permitir la aplicación repetida de ambos agentes terapéuticos y etiquetas fluorescentes. También es posible prever placas superiores con estuches para la grabación de electrodos, insertos ópticos y puertos para suministro de fármacos. Tales adiciones probablemente serían más difíciles de poner en práctica el uso del sistema más minimalista de Fenrich et al., 31. En conclusión, nuestro cámara proporciona una plataforma de puerta de enlace sobre el cual se pueden basar diversos experimentos.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |