In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse in vivo microscopie in intacte organismen in staat stelt de directe visualisatie van complexe biologische processen die niet toegankelijk zijn voor de traditionele single-tijdstip analyse, zoals immunohistochemie. Specifiek, multi-photon microscopie (MPM) 1 maakt beeldvorming strooischijf weefsel, zoals knaagdieren neocortex, waar beeldvorming tot 2,3 en meer dan 4 1 mm is bereikt. In combinatie met chirurgische preparaten 5-7 waarin één procedure kan optische toegang tot de hersenen gedurende weken tot maanden, zijn deze microscopie benaderingen gebruikt om dynamische processen in de hersenen van gezonde en zieke toestanden 8-11 bestuderen. Daarnaast zijn protocollen ontwikkeld 12,13 die voor in vivo beeldvorming wakker (dwz niet verdoofde) dieren, waardoor cellulaire resolutie functionele beeldvorming tijdens behavioral tests. Deze protocollen zijn gebruikt voor comparisons van gecorreleerde neuronale activiteit 14, astrocyten calcium signalering 15 in verdoofde en wakkere dieren, de identificatie van taakspecifieke neuronale clusters 16, en het vermogen van neuronen om objectlocatie discrimineren op snorhaar stimulatie 17.
Gezien het potentieel van deze benadering helderen gezonde en pathologische mechanismen time-lapse in vivo beeldvorming werd op de muis ruggenmerg (SC), voor de identificatie van acute axonale degeneratie (AAD) als ziektemechanisme 18. Latere studies onderzochten effecten van perifere laesies op de dorsale wortel ganglia (DRG) axon regeneratie 19, de rol van bloedvaten in axon regeneratie 20, gliale chemotaxis in respons op letsel 21, T-celmigratie in experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) 22 activiteit van microglia en astrocyten 23,24 25 reactie op amyotrophic laterale sclerose (ALS), de rol van de STAT-3 in axonale kiemen na SC letsel (SCI) 26, en een mechanisme van axon verlies en herstel in EAE 27. Ondanks het succes van deze benaderingen werden al deze studies beperkt tot een enkele opnamesessie, waardoor studies beperkt tot kortetermijndynamiek of anders vereist herhaalde chirurgische openingen van het dier op elk tijdstip beeldvorming, beperken van het aantal tijdstippen toegankelijk en het vergroten van de kans op verstorende experimentele artefacten. Protocollen voor deze operaties zijn eerder 28,29 gepubliceerd.
Onlangs publiceerde we een techniek 30 voor de implantatie van een chronische spinale kamer die time-lapse MPM beeldvorming in de muis SC gedurende meerdere weken ingeschakeld zonder herhaalde operaties. In het kort, deze chirurgische preparaat uitvoeren laminectomie in de onderste thoracale wervelkolom en de implantatie van een vierdelige kamer. De kamer opgenomendrie aangepaste-bewerkte onderdelen van roestvrij staal dat de wervels rond de laminectomie, en een glas dekglaasje geplaatst over de SC en vastgezet met siliconen elastomeer geklemd. Deze techniek toegestaan voor routine beeldvorming uit tot meer dan 5 weken na de operatie in gezond en gewond staten zonder de noodzaak voor herhaalde operaties. Het aantal beeldvormende tijdstippen werd beperkt door de frequentie waarbij het dier anesthetische inductie kan verdragen. Imaging levensduur beperkt door de groei van een dichte vezelachtige weefsel over het oppervlak van de SC. Daarnaast hebben we vastgesteld dat de chirurgische implantaten op lange termijn geen effect op de motorische functie gehad.
Sinds onze eerste publicatie, hebben alternatieve benaderingen waarmee tevens de lange termijn beeldvorming in de SC elders 31-33 beschreven. Dit protocol toont onze procedure voor het implanteren van de spinale ruimte die we ontwikkeld.
De techniek hier gedemonstreerd maakt herhaalde, time-lapse, in vivo beeldvorming van de dorsale muis SC uitgevoerd met vele weken na de operatie zonder verdere chirurgische procedures. Deze procedure betekent een aanzienlijke verbetering ten opzichte van repeat-operatie imaging studies of boven portmortem histologische benaderingen, waar informatie over cellulaire dynamiek verloren gaat. We hebben eerder aangetoond dat 30 de waarde van deze techniek voor het bestuderen SCI pathologie in vivo.
De maximale langsuitstrekking van beeldvorming werd bepaald door de groei van een dichte vezelachtige weefsel over het dorsale oppervlak van de SC. Mettertijd groei tot het verlies van beeldcontrast en resolutie. Deze groei is ook gezien in alternatieve chirurgische preparaten 31. Anecdotally hebben waargenomen dat deze groei kan worden geminimaliseerd door voorzichtig wassen van de dorsale SC oppervlak bloedproducten te verwijderen, verzegelen het oppervlak vande snede bot met cyanoacrylaat, afdichtranden van de kamer goed met siliconen elastomeer, en het minimaliseren van de interstitiële ruimte tussen de dorsale SC en de dekking van glas.
Onlangs heeft een andere benadering vergelijkbaar met onze eigen gebruik van een polycarbonaat kamer aangetoond 32. Het gebruik van polycarbonaat is voordelig omdat het compatibel is met röntgen en akoestische beeldvormingsmodaliteiten, wat niet het geval is voor onze roestvrij stalen onderdelen. Echter, met de nu alomtegenwoordige technologie van 3D printers kamerdelen kunnen worden vervaardigd uit een grote verscheidenheid van materialen voor specifieke behoeften. We hebben onlangs afgedrukt al onze onderdelen in een duidelijke fotopolymeer.
Een belangrijk nadeel van een gesloten kamer is het onvermogen om herhaalde doseringen van geneesmiddelen of exogene kleurstoffen geschikt voor SC beeldvorming 34 beheren. Echter, door te profiteren van de mechanische stabiliteit van ons huidige systeem, we hebben al gebruik gemaakt van onze huidige kamer om succesvolly verankeren een intrathecale katheter aangesloten op een subcutaan geïmplanteerde injectie-poort, die zelfs in een gesloten kamer systeem (ongepubliceerd werk) toegestaan voor de afgifte van geneesmiddelen op verschillende tijdstippen. Verder komt door de modulaire aard van de bovenplaat toekomstige versies van dit preparaat omvat een afsluitbare kamer om voor herhaalde toepassing van zowel therapeutische middelen en fluorescente labels. Het is ook mogelijk kopplaten met mounts voorstellen voor het opnemen van elektroden, optische inserts en poorten voor geneesmiddelafgifte. Zulke toevoegingen zouden waarschijnlijk moeilijker te implementeren met behulp van de meer minimalistische systeem van Fenrich et al. 31. Concluderend onze kamer kan gateway platform waarop verschillende experimenten kan worden gebaseerd.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |