High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
Het doel van fluorometrische analyse dienen als een efficiënte, rendabele, high throughput werkwijze voor het analyseren fagocytose en andere cellulaire processen. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van celtypen, zowel hechtende en niet-hechtende, om een verscheidenheid van cellulaire eigenschappen onderzocht. Bij het bestuderen van fagocytose, fluorometrische technieken gebruikt fagocytische celtypes zoals macrofagen en fluorescent gelabelde geopsoniseerde deeltjes waarvan de fluorescentie gedoofd in aanwezigheid van trypan blauw. Na plating hechtende macrofagen in 96-well platen, fluorescerende deeltjes (groen of rood) toegediend en cellen mogen fagocyteren voor uiteenlopende hoeveelheden tijd. Na internalisering van fluorescerende deeltjes, worden de cellen gewassen met trypan blauw, die uitdoving van fluorescent signaal maakt van bacteriën die niet zijn geïnternaliseerd, of alleen hechten aan het celoppervlak. Na de trypan wassen worden de cellen gewassen met PBS, gefixeerd, eennd gekleurd met DAPI (nucleaire blauw fluorescent label), die dient om kernen van cellen te labelen. Door een simpele fluorometrisch kwantificering door plaat lezing van nucleaire (blauw) of een deeltje (rood / groen) fluorescentie kunnen we de verhouding van de relatieve fluorescentie-eenheden van groene onderzoeken: blauw en bepalen een fagocytische index indicatief bedrag van fluorescerende bacteriën geïnternaliseerd per cel. De duur van de test met behulp van een 96-well methode en multichannel pipetten voor het wassen, van eind tot eind fagocytose data acquisitie, minder dan 45 min. Flowcytometrie kan worden gebruikt op soortgelijke wijze maar het voordeel van fluorometrie is zijn hoge throughput, snelle beoordelingsmethode met minimale manipulatie van monsters en snelle kwantificering van fluorescentie-intensiteit per cel. Soortgelijke strategieën kunnen worden toegepast op niet hechtende cellen, levende gemerkte bacteriën, actine polymerisatie en wezen elke werkwijze waarbij fluorescentie. Daarom fluorometrie is een veelbelovende methode voor de lage kosten, hoge throughput-mogelijkheden in de studie van cellulaire processen.
Introduction
Kwantificering van fluorescentiesignaal is op grote schaal gebruikt in een groot aantal wetenschappelijke methoden variërend van PCR, flowcytometrie, confocale microscopie en FRET analyse multiplexen ELISA. Fluorescentie beeldvorming en kwantificering heeft een brede toepassing en kan een geweldig hulpmiddel voor de kwantitatieve analyse van verschillende cellulaire processen zijn. Het gebruik van fluorescente merkers en het signaal is een revolutie in het afgelopen decennium ontstaan van fluorescerende plaatlezers heeft de hoge doorvoer kwantificering van fluorescentie uitgezonden tijdens cellulaire processen vergemakkelijkt.
Fluorimetrische analyse kan dienen als een groot hulpmiddel kwantificering van fagocytose. Fagocytose is onderzocht sinds de ontdekking van fagocyten door Metchnikoff in 1800 1. Loop der jaren is een verscheidenheid van werkwijzen toegepast om deze belangrijke proces onderzoekt essentieel innate immune afweer tegen binnendringende bacteriën, virussen, schimmels en parasitaire pathogenen 2-5. Vorige werkwijzen kwantificering gebruikte microscopie en stereological technieken om cellen die fagocytose, die vervolgens werden gekwantificeerd door het tellen van geïnternaliseerde deeltjes (handmatig of met behulp van software) 6-8 visualiseren. Een aantal nadelen aan het gebruik van microscopie alleen voor de kwantitatieve analyse zijn dat handmatige telling van bacteriën is arbeidsintensief en meer vatbaar voor waarnemer vooringenomenheid. Een andere werkwijze die voor kwantificering van fagocytose is de microbiologische techniek uitplaten van bacteriën uit cellysaten (na fagocytose) van bacteriën kweekplaten, maar deze methode kan alleen verklaren bactericide mechanismen en aanwezigheid van gedeeltelijk geïnternaliseerde bacteriën. Deze methode is nog arbeidsintensiever vergelijking met microscopie en duurt enkele dagen te analyseren. Flowcytometrie lijkt de snelste, meest effectieve manier om fagocytose te kwantificeren zijn en is gebruikt door vele groepen 9-11, maar de hoge kosten vaak geassocieerd met de instrument oog op de analyse maakt het de meest dure methode in vergelijking met de eerder genoemde assays.
De fluorometrische werkwijze is een goed alternatief voor flowcytometrie analyse van deeltjes internalisatie omdat het biedt onpartijdige kwantificering van fluorescentie met apparatuur die niet zo onbetaalbaar. Andere extra voordelen van fluorometrie zijn hoge efficiency, en hoge doorvoer mogelijkheden voor het kwantificeren van fluorescentie uitgezonden door de gelabelde geïnternaliseerde deeltjes.
Voordelen van fluorometrie kan worden geëxtrapoleerd naar kwantificering van andere dan fagocytose processen. Zo kan fluorometrische analyse toegepast op elk proces dat leidt tot veranderingen in expressie van intracellulaire of membraangebonden receptoren, veranderingen in celdoorlaatbaarheid / levensvatbaarheid, transfectie efficiëntie en modulatie in actine polymerisatie bestuderen. Een nadeel van fluorometrische techniek is dat, afhankelijk van de gebruikte etiketten, kan er een hoogexperiment om variabiliteit die meestal kan worden opgelost door aan te tonen van gegevens door middel van relatieve kwantificatie, zoals voudige verandering of procent stijging van controle experimenteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belangrijke beperkingen van de fluorometrische technieken zijn variantie en celverlies geassocieerd met uitgebreid wassen en gebruik van niet-hechtende cellen.
Variantie is grotendeels waargenomen als gevolg van de variatie in de fluorescente deeltjes wegen en pipetteren tijdens de bereiding van de voorraadoplossing geen exacte manier die hetzelfde aantal deeltjes uit experiment experimenteren. Om het probleem van de variantie tussen de experimenten aan te pakken, kunnen de gegevens worden u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. , (2012).
- Burke, D. W., O’Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
