تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
والهدف من التحليل فلوروميتريك هو بمثابة وفعالة من حيث التكلفة، طريقة إنتاجية عالية الكفاءة في تحليل البلعمة والعمليات الخلوية الأخرى. هذه التقنية يمكن استخدامها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، سواء ملتصقة وغير ملتصقة، لدراسة مجموعة متنوعة من الخصائص الخلوية. عند دراسة البلعمة، تقنية فلوروميتريك تستخدم أنواع الخلايا البلعمية مثل الضامة، والجزيئات opsonized fluorescently المسمى الذي يمكن أن تسقط في وجود الأزرق التريبان مضان. وبعد الطلاء الضامة ملتصقة في لوحات 96-جيدا، والجسيمات الفلورية (الأخضر أو الأحمر) تدار ويتم السماح خلايا في phagocytose لكميات متنوعة من الوقت. وبعد استيعاب جزيئات الفلورسنت، ويتم غسلها الخلايا مع الأزرق التريبان، مما يسهل انقراض إشارة الفلورسنت من البكتيريا التي لا المنضوية، أو مجرد التمسك سطح الخلية. بعد غسل التريبان، يتم غسلها الخلايا مع PBS، ثابتة، وهيالثانية ملطخة دابي (التسمية الفلورسنت الزرقاء النووية)، والذي يعمل على تسمية نوى الخلايا. من جانب الكمي فلوروميتريك بسيط من خلال لوحة قراءة النووي (الأزرق) أو الجسيمات (أحمر / أخضر) مضان يمكننا فحص نسبة الوحدات مضان النسبية للأخضر: أزرق وتحديد مؤشر أكلة يدل على كمية من البكتيريا الفلورية المنضوية لكل خلية. مدة الفحص باستخدام طريقة والأقنية 96-جيدا الماصات لغسل، من نهاية البلعمة لوضع حد من الحصول على البيانات، هو أقل من 45 دقيقة. التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم بطريقة مماثلة ولكن الاستفادة من التألق هو الإنتاجية العالية، طريقة سريعة للتقييم مع التلاعب الحد الأدنى من العينات وتقدير سريع للكثافة الفلورسنت لكل خلية. استراتيجيات مماثلة يمكن تطبيقها على الخلايا غير ملتصقة والبكتيريا وصفت العيش، الأكتين البلمرة، وأساسا لأي عملية الاستفادة من مضان. ولذلك، التألق هي طريقة واعدة لتكلفة منخفضة، throughp أعلى مستوياتهقدرات UT في دراسة العمليات الخلوية.
Introduction
الكمي للإشارة الفلورسنت وقد استخدم على نطاق واسع في العديد من الأساليب العلمية التي تتراوح بين PCR، التدفق الخلوي، الفحص المجهري متحد البؤر، والحنق التحليل لمعدد ELISA. التصوير مضان وتقدير له تطبيق واسع النطاق ويمكن أن يكون أداة عظيمة للتحليل الكمي من العمليات الخلوية المختلفة. وقد أحدثت ثورة استخدام علامات الفلورسنت وإشارة في العقد الماضي، وظهور القراء لوحة الفلورسنت يسر الكمي إنتاجية عالية من مضان المنبعثة خلال العمليات الخلوية.
تحليل فلوروميتريك يمكن أن تكون بمثابة أداة عظيمة في تقدير حجم البلعمة. وقد تمت دراسة البلعمة منذ اكتشاف البالعات التي كتبها ميتشنيكوف في عام 1800 1. وعلى مر السنين، وقد تم استخدام مجموعة متنوعة من الأساليب لدراسة هذه العملية الهامة ضرورية للدفاع ضد غزو المناعة الفطرية البكتيرية، الفيروسية، الفطرية والطفيلية الممرضة 2-5. الأساليب السابقة من تقدير تستخدم المجهري وتقنيات stereological من أجل تصور الخلايا التي يتم phagocytosing، ثم جرى كميا عن طريق عد من الجسيمات المنضوية (يدويا أو باستخدام البرمجيات) 6-8. بعض العيوب باستخدام المجهر وحده للتحليل الكمي هي أن العد والفرز اليدوي من البكتيريا هو عمالة كثيفة وأكثر عرضة للانحياز مراقب. طريقة أخرى تستخدم في القياس الكمي للالبلعمة هي التقنية الميكروبيولوجية من الطلاء من البكتيريا من الخلية لست] (بعد البلعمة) على لوحات ثقافة البكتيرية، ولكن هذا الأسلوب يمكن أن تفشل لحساب آليات للجراثيم وجود البكتيريا المنضوية جزئيا. هذا الأسلوب هو المزيد من العمل المكثف مقارنة المجهري ويأخذ عدة أيام لتحليلها. التدفق الخلوي يبدو أن يكون أسرع وأنجع وسيلة لقياس البلعمة وتم استخدامها من قبل العديد من الجماعات 9-11، ولكن التكلفة العالية المرتبطة عادة مع فيstrument اللازمة لتحليل يجعل من الأسلوب الأكثر مكلفة بالمقارنة مع المقايسات التي سبق ذكرها.
طريقة فلوروميتريك هو بديل جيد لالتدفق الخلوي لتحليل الجسيمات الداخلي لأنه يقدم الكمي غير منحازة من مضان باستخدام المعدات التي ليس كما باهظة التكلفة. فوائد إضافية أخرى من التألق وكفاءة عالية، وقدرات إنتاجية عالية لقياس مضان المنبعثة من جزيئات المنضوية المسمى.
فوائد التألق يمكن استقراء لتقدير حجم العمليات الأخرى من البلعمة. على سبيل المثال، تحليل فلوروميتريك يمكن تطبيقها لدراسة أي عملية تؤدي إلى تغييرات في التعبير عن داخل الخلايا أو مستقبلات غشاء محدد، والتغيرات في نفاذية الخلية / الجدوى والفعالية ترنسفكأيشن، وتعديل في الأكتين البلمرة. واحد السلبي لتقنية فلوروميتريك هو أنه، اعتمادا على التسميات المستخدمة، قد يكون هناك ارتفاعتجربة لتجربة تقلب التي يمكن عادة أن تحل من خلال إظهار البيانات من خلال الكمي النسبي، مثل تغير أضعاف أو الزيادة في المئة من السيطرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القيود الرئيسية للتقنية فلوروميتريك هي التباين التجريبية فضلا عن فقدان الخلايا المرتبطة الغسيل واستخدام الخلايا غير ملتصقة واسعة النطاق.
ويلاحظ التباين إلى حد كبير بسبب الاختلاف في جزيئات الفلورسنت كما وزنها وpipetting لأثناء إعد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. , (2012).
- Burke, D. W., O’Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
