We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
El procedimiento experimental descrito aquí permite etiquetado neuronas sensoriales del órgano olfativo de X. larval laevis por electroporación de dextranos fluoróforo acoplado y la posterior visualización de crecimiento axonal sensorial en el animal vivo. Mediante la variación de los parámetros de la electroporación in vivo es posible controlar el número de neuronas sensoriales etiquetados. Es por lo tanto posible etiquetar grandes grupos de neuronas de un epitelio sensorial, muy pocos o incluso células individuales.
Para asegurar la deseada extensión de etiquetado neuronal es importante ser particularmente cauteloso sobre las características de micropipeta y los pulsos de electroporación. Resistencias más altas de pipeta y la reducción de la amplitud de pulso de voltaje, duración y número de repeticiones pueden reducir la cantidad de células marcadas, mientras que la disminución de las resistencias de las pipetas y una mayor amplitud de pulso de voltaje, duración y número de pulsos puede conducir a un etiquetado más generalizada. The uso de dextranos fluorescentes para la electroporación proporciona retroalimentación visual inmediata si los ajustes aplicados son apropiados. Tenga cuidado de que el uso de parámetros de amplitud, duración y número de pulsos que exceden los valores previstos en el protocolo puede potencialmente conducir a daño celular o incluso la muerte celular 17. Consejos obstruidos o rotos de micropipetas también pueden dificultar la electroporación éxito.
En electroporación in vivo en el órgano olfativo de X. laevis se limita a estadios larvarios ya que la piel de ranas postmetamorphotic es más dura y no puede ser fácilmente penetrado con una micropipeta. La visualización en vivo de los procesos neuronales puede verse obstaculizado por la dispersión de la luz de excitación / emisión en las zonas más profundas del cerebro o por los vasos sanguíneos. Este problema se hace especialmente evidente en estadios larvarios más altos debido a un cerebro más grande y puede dar lugar a señales ruidosas haciendo la clara identificación de los procesos axonales finas más difícil.
<pclass = ""> jove_content permisos El protocolo presentado para visualizar las neuronas sensoriales en el sistema olfatorio intacto sin disección del animal, dañando las células durante el etiquetado, preparación de cortes de tejido o la fijación del tejido que sea necesario para los métodos alternativos, como el etiquetado en el parche de células enteras experimentos -clamp 18. Cuando se combinan el etiquetado de los pocos o individuales con las neuronas sensoriales en vivo de imágenes de lapso de tiempo, es posible visualizar las conexiones glomerulares de las neuronas sensoriales maduros individuales durante intervalos de tiempo largos. De esta manera también es posible monitorizar el desarrollo de los patrones de proyección axonal de las neuronas sensoriales inmaduros durante varias semanas. Esta última opción es particularmente interesante ya que permite el seguimiento de los patrones de crecimiento de los axones individuales en el animal vivo. Esto abre la posibilidad de investigar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la orientación axón y búsqueda de caminos. Varios factores, incluyendo la expresión del receptor odorante, varios Axomoléculas de orientación y n / actividad espontánea olor inducida de las neuronas sensoriales han sido demostrado que regulan el hallazgo de destino de los axones de las neuronas sensoriales 4,5.La aplicación del protocolo no se limita a las neuronas sensoriales olfativas, pero también se puede aplicar para estudiar otros tipos de células, por ejemplo., Las células madre / progenitoras de las zonas neurogénicos del cerebro en desarrollo o las células mitrales del bulbo olfativo. Además, la técnica mostrada también se puede utilizar en combinación con dextranos de calcio sensibles o se inyecta colorantes de calcio de membrana permeable para obtener información funcional sobre la neurona marcado y / o el sistema de circuitos conectado 7,19. La disponibilidad de una amplia gama de fluoróforos acoplados a dextranos permite el etiquetado de múltiples células individuales o poblaciones con diferentes colores. También plásmido solución de ADN, por ejemplo de codificación para las proteínas fluorescentes, es adecuado para la electroporación y se puede mejorar aún más la versatiliTy y utilidad de la técnica 6. El protocolo puede ser mejorado aún más para permitir que la electroporación combinada de dextranos y ADN o morfolinos cargadas para manipular la expresión génica 13,17.
El método descrito sin duda representa una nueva herramienta para investigar la compleja y procesos aún no se entiende completamente que regulan la guía axonal en el sistema olfativo de los vertebrados.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |