We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
La procedura sperimentale qui descritta permette di etichettatura neuroni sensoriali del organo olfattivo di X. larvale laevis mediante elettroporazione di destrani fluoroforo ad accoppiamento e la successiva visualizzazione di crescita assonale sensoriale nell'animale vivente. Variando i parametri della elettroporazione in vivo è possibile controllare il numero di neuroni sensoriali etichettati. E 'quindi possibile etichettare grandi gruppi di neuroni di un epitelio sensoriale, molto pochi o addirittura singole cellule.
Per garantire la desiderata estendere dell'etichettatura neuronale è importante essere particolarmente prudenti sulle caratteristiche micropipetta e gli impulsi di elettroporazione. Più elevate resistenze pipetta e la riduzione di impulso di tensione di ampiezza, durata e numero di ripetizioni in grado di ridurre la quantità di cellule marcate, considerando che una riduzione resistenze pipetta e una maggiore ampiezza di impulso di tensione, la durata e il numero di impulsi può portare l'etichettatura indicante il più diffuso. The l'uso di destrani fluorescenti per l'elettroporazione fornisce un feedback visivo immediato se le impostazioni applicate sono adeguate. Fare attenzione che l'utilizzo di parametri di ampiezza, durata e numero di impulsi che superano i valori previsti dal protocollo può potenzialmente portare a danni delle cellule o anche morte cellulare 17. Suggerimenti intasati o rotti di micropipette possono anche ostacolare l'elettroporazione di successo.
In elettroporazione in vivo nell'organo olfattivo di X. laevis è limitato a stadi larvali poiché la pelle di rane postmetamorphotic è più duro e non può essere facilmente penetrato con una micropipetta. La visualizzazione in vivo dei processi neuronali può essere ostacolata dalla dispersione della luce di eccitazione / emissione in aree cerebrali profonde o da vasi sanguigni. Questo problema diventa particolarmente evidente nelle fasi larvali più elevati a causa di un cervello più grande e può portare a segnali rumorosi rendendo la chiara identificazione dei processi assonali fini più difficile.
<pclass = ""> jove_content permessi protocollo presentato per visualizzare i neuroni sensoriali nel sistema olfattivo intatto, senza sezionare l'animale, danneggiare le cellule durante l'etichettatura, la preparazione di fette di tessuto o il fissaggio del tessuto necessario per i metodi alternativi, come l'etichettatura in zona whole-cell esperimenti -clamp 18. Quando si combinano l'etichettatura di alcuni o di singoli neuroni sensoriali con in vivo lasso di tempo di imaging, è possibile visualizzare le connessioni glomerulari di singoli neuroni sensoriali maturi su intervalli di tempo lunghi. In questo modo è possibile monitorare lo sviluppo dei modelli di proiezione assonale dei neuroni sensoriali immaturi per diverse settimane. Quest'ultima possibilità è particolarmente interessante in quanto consente il monitoraggio dei modelli di crescita di singoli assoni nell'animale vivente. Questo apre la possibilità di indagare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la guida degli assoni e pathfinding. Diversi fattori, tra cui l'espressione del recettore odorizzante, vari axon molecole di orientamento e di odorizzante indotta / attività spontanea dei neuroni sensoriali hanno dimostrato di regolare la constatazione bersaglio degli assoni dei neuroni sensoriali 4,5.L'applicazione del protocollo non è limitata ai neuroni sensoriali olfattivi, ma può essere applicato anche per studiare altri tipi di cellule, ad es., Cellule staminali / progenitrici delle zone neurogenici del cervello sviluppo o cellule mitrali del bulbo olfattivo. Inoltre la tecnica dimostrata può essere utilizzato anche in combinazione con destrani sensibili calcio o iniettata coloranti calcio membrana permeabile per ottenere informazioni funzionali sul neurone etichettati e / o la circuiteria collegata 7,19. La disponibilità di una vasta gamma di fluorofori accoppiati a destrani consente etichettatura dei molteplici singole cellule o di popolazioni con colori diversi. Inoltre plasmide soluzione di DNA, per esempio codifica per proteine fluorescenti, è adatto per elettroporazione e può migliorare ulteriormente l'versatiliTy e l'utilità della tecnica 6. Il protocollo può essere ulteriormente migliorato per consentire l'elettroporazione combinato di destrani e del DNA o Morpholinos a carico manipolare l'espressione genica 13,17.
Il metodo descritto rappresenta certamente un nuovo strumento per indagare il complesso e processi ancora pienamente compreso che regolano la guida assonale nel sistema olfattivo dei vertebrati.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |