Summary

חזותי exocytosis ללא ממס של<em> Neoformans קריפטוקוקוס</em> מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Published: October 21, 2014
doi:

Summary

אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.

Abstract

היבטים של הזיהום של מקרופאגים ידי neoformans קריפטוקוקוס רבים נחקרו רבים ומוגדרים היטב. עם זאת, אינטראקציה מסוימת שאינו מובנת באופן ברור הוא exocytosis לא אלים. בתהליך זה, תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי על ידי מנגנון הבין היטב שמשאיר את שני מקרופאג וCn קיימא. כאן, אנו מתארים כיצד לעקוב מספר גדול של מקרופאגים נגועים בנפרד לתקופה זיהום 24 שעות על ידי מיקרוסקופ-פקע זמן. מקרופאגים נגועים הם שוכנו בתא חימום עם CO 2 אווירה מחוברת למיקרוסקופ המספק את אותם תנאים כמו חממת טכנולוגיה של תרבית התאים. מיקרוסקופיה דיגיטלית חי יכולה לספק מידע על האינטראקציות הדינמיות בין מארח ופתוגן שאינו זמין מתמונות סטטיות. יכולת לדמיין כל תא נגוע יכול לספק רמזים באשר לאופן מקרופאגים להתמודד זיהומים פטרייתיים, ולהיפך. אני טכניקה זוכלי רב עוצמה sa בלימוד הדינמיקה שנמצאות מאחורי תופעה מורכבת.

Introduction

השלבים של זיהום פטרייתי בין תאים ומקרופאגים cryptococcal מתועדים היטב 1-3. לאחר תאי שמרים הם מעובדים על ידי מקרופאגים, מגוון רחב של אינטראקציות עלול להתרחש: מקרופאג עשוי lyse שחרור העומס פטרייתי שלה לתוך מרחב החוץ תאי, או שזה יכול לשלוט בזיהום על ידי שמירה על תאי שמרים בתוך גבולות קרום התא שלו 4. עם זאת, לפני כמה שנות תוצאה חדשה שתוארה באופן עצמאי על ידי שתי קבוצות: exocytosis לא אלים, תהליך שבו מקרופאג נמחק כל תאי cryptococcal או לסביבה או תא השכן והן המארח והפתוגן להישאר קיימא 5 -8. מספר מחקרים ניסו להבין את המנגנונים המולקולריים מאחורי אינטראקציה זו, אך עדיין אין לנו הבנה מלאה על מה שמניע את התופעה הזאת.

היכולת ללכוד תמונות בזמן אמת ולאחר מכן לאחר מכן לנתח להדביק מרובהעורך מקרופאגים מאפשר לענות על שאלות רבות על התכונות הפיזיות המקיפות exocytosis לא אלים בכל הקשור לעיתוי, יכולת מרחבית, שינוי במורפולוגיה ואפילו לחץ של מקרופאגים בזיהום פטרייתי. ידי מתן אפשרות לתאים להיות שוכנו בסביבה שדומה לזו של חממה, אנו יכולים להציץ באופי הדינמי של אינטראקציות תא מקרופאג פטרייתי. חוקרים השתמשו בטכניקה זו כדי ללמוד מרכיבים שונים של תהליך זה. התפקיד של phagosome בתהליך זה נעשה לכאורה באמצעות מכתים הניאון ויקטינו סוכני חסימה 9, בעוד שקבוצה אחרת השתמשה בשיטה זו כדי להראות שexocytosis לא אלים נחסם בתאים שהיו WASH nucleating תחומים חלבון נמחק 10. ההשפעה של איתות ציטוקינים גם הובררה באמצעות מיקרוסקופ בזמן אמת 11. תהליך זה אינו מוגבל לג neoformans כפי שגם נצפה עם קנדידה אלביקנס, another פתוגן פטרייתי שיש לו את היכולת להדביק מקרופאגים 12. ממצאים אלה הם דוגמאות לאופן ששיטה זו יכולה לספק שפע של מידע לאזור שאנחנו יודעים כל כך מעט על.

Protocol

כל העבודה של בעלי החיים שנעשתה בהתאם לתקנות והנחיות של המכון לבעלי חי לימודים אלברט איינשטיין המכללה לרפואה. 1 תנאי גידול של ג neoformans H99 (סרוטיפ) לגדול ג פרט מושבות neoformans…

Representative Results

התמונות שטכניקה זו מייצרת ניתן לנתח במגוון רחב של דרכים לאיסוף מידע המקיף את מה שקורה אחרי התאים phagocytosed ג neoformans. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם כ 100 מקרופאגים שהם או נגועים או נגוע. כל אחד ממקרופאגים אלה מעניק לצופה הזדמנות ללמוד אינטראקציות מאכסן לפתוגן ב…

Discussion

כאן יש לנו תארנו שיטה שבאמצעותה ניתן להקליט אינטראקציות פטרייתי-macrophage ומנותח בזמן אמת על פני תקופה 24 שעות. המעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי ללמוד רב של ההיבטים זמניים של exocytosis לא אלים ותמשיך להשתמש במיקרוסקופ בזמן אמת כדי לברר את הרכיבים מורפולוגיים המקיפים את הת…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן בחלקו על ידי הפרסים NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Materials

Sabouraud Dextrose Agar BD DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth BD DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)  Atlanta Biologicals S12450
NCTC 109 Invitrogen 21340-039
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
HEPES Buffer Corning Cellgro 25-060-Cl
Glutamax Invitrogen 35050-061
Non-essential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-Cl
2-Mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes  Fisher Scientific  08772E
CellStripper Corning Cellgro 25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes MatTek P35GC-1.5-14-C
LPS Sigma L3137
Mouse IFN-g Roche NC 9222016
mAb 18B7        Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber Zeiss

References

  1. Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
  2. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
  3. Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
  4. Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
  5. Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
  6. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
  7. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
  8. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
  9. Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
  10. Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
  11. Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
  12. Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).

Play Video

Cite This Article
Stukes, S., Casadevall, A. Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e52084, doi:10.3791/52084 (2014).

View Video