Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Saggi placca rimangono uno dei metodi più accurati per la quantificazione diretta di virons infettivi e sostanze antivirali attraverso il conteggio delle placche discreti (unità infettive e le zone morte cellulare) in coltura cellulare. Qui mostriamo come eseguire un saggio di placca di base, e come sovrapposizioni e tecniche differenti in grado di influenzare la formazione di placca e la produzione. Tipicamente substrati sovrapposizione solidi o semisolidi, come agarosio o carbossimetilcellulosa, sono stati utilizzati per limitare la diffusione virale, impedendo l'infezione indiscriminata attraverso il terreno di coltura liquido. Sovrapposizioni immobilizzati limitano infezione cellulare per il monostrato immediatamente circostante, consentendo la formazione di foci discreta numerabile e la successiva formazione della placca. Per superare le difficoltà insite nell'uso sovrapposizioni tradizionali, una sovrapposizione di liquido romanzo utilizzando cellulosa microcristallina e carbossimetilcellulosa di sodio è stato sempre più utilizzato come sostituto nella normasaggio di placca. Overlay test placca liquidi possono essere facilmente eseguite in entrambi i formati lastra e standard di 6 o 12 secondo le tecniche tradizionali e non richiedono attrezzature speciali. Grazie al suo stato liquido e successiva facilità di applicazione e rimozione, formati lastra microcultura possono inoltre essere utilizzati come un rapido, preciso e throughput elevato alternativa titolazioni virali scala più grande. L'uso di un polimero liquido viscoso riscaldato non offre la possibilità di snellire il lavoro, conserva i reagenti, spazio incubatore, e aumenta la sicurezza operativa quando viene utilizzato nei laboratori tradizionali o alti di contenimento, come il riscaldamento del reagente o vetreria sono obbligatori. Sovrapposizioni liquidi possono anche rivelarsi più sensibili di overlay tradizionali per alcuni di calore virus labili.
L'isolamento e la quantificazione accurata di campioni virali vitali è stata sempre un obiettivo di ricerca in corso in virologia. Non è stato fino all'avvento del saggio di placca nel 1952 che un mezzo per calcolare quantitativamente e qualitativamente titoli virali di origine animale per la prima volta messo a punto 1,2. Questa tecnica è stato adattato e modificato da saggi fagi, che era stato precedentemente utilizzato per calcolare titoli azionari di batteriofagi in biologia vegetale 1,2. Mentre mezzi alternativi per la quantificazione virale da allora sono stati sviluppati e adattati, come ad esempio immunologiche, fluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione, il rilevamento degli impulsi resistivo regolabile (TRPS), citometria a flusso, sistemi di giornalista ricombinanti, e inverso quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) , questi metodi non riescono a identificare e quantificare replica virons competenti 1,3. Mentre i progressi delle tecnologie e delle tecniche continuano a perfezionare e modificare il paesaggio; plaque saggi continuano a rappresentare il gold standard per determinare le concentrazioni virali infettive per virons litiche 1,4.
Nel corso di un saggio di placca, un monostrato confluente di cellule ospiti è stato infettato da un virus litico di una concentrazione sconosciuta che è stata diluita in serie ad una serie numerabile, in genere tra 5-100 virioni. Monostrati infetti vengono poi coperti con un mezzo di copertura immobilizzante per prevenire l'infezione virale da diffondere indiscriminatamente sia attraverso il flusso meccanico o convezione del mezzo liquido durante la propagazione virale. Mentre sono stati tradizionalmente utilizzati sovrapposizioni solidi o semisolidi come agarosio, metilcellulosa e carbossimetilcellulosa (CMC), sovrapposizioni liquidi sono diventati un'alternativa sempre più attraente con lo sviluppo di nuovi strati liquidi come Avicel 5- 7. Saggi placca che utilizzano liquido contro le sovrapposizioni tradizionali presentano diversi vantaggi come la sovrapposizione può essere applicato a temperatura ambiente, e l'applicazione e la rimozione è molto più semplice. Come sovrapposizioni liquidi non necessitano di riscaldamento, virus labili delicate e di calore possono anche risultare più facile placca.
Dopo l'infezione iniziale e l'applicazione della sovrapposizione immobilizzare, singole placche o zone di morte cellulare, inizierà a sviluppare infezione e la replicazione virale sono vincolati al monostrato circostante. Cellule infettate continuerà il ciclo di replica-lisi-infezione si propaga ulteriormente l'infezione, con conseguente placche sempre più distinti e discreti. A seconda della cinetica di crescita e di accoglienza delle cellule virale utilizzato, una targa visibile normalmente formare entro 2-14 giorni. Monostrati cellulari possono poi essere contate con un microscopio a campo chiaro normale, o più tipicamente fissi e contrastate dal rosso neutro o violento cristallo per identificare prontamente placche ad occhio nudo. Vi è un'ampia varietà di macchie contatore placca disponibili, ciascuna offerta thEIR vantaggi e svantaggi specifici. Cristal violetto è tipicamente aggiunto nel punto di raccolta e dopo il fissaggio / rimozione della sovrapposizione, fornendo una macchia contatore rapida e distinta che consente l'identificazione di piccole placche quando morfologia mista è presente. Rosso neutro ha il vantaggio di prima applicazione e il contatto costante con la sovrapposizione, consentendo il monitoraggio in tempo reale di sviluppare la formazione della placca, che è particolarmente utile quando si lavora con uno sconosciuto virus o di replica cinetica. Abbiamo però scoperto che la colorazione non è in genere distinto durante l'utilizzo rosso neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) offre numerosi vantaggi, come le macchie gialle colorante cellule vive scuro placche blu e virali possono essere contati senza rimozione della sovrapposizione come con rosso neutro. L'elevato contrasto tra cellule vive e morte offerte dalla MTT permette anche la rilevazione di piccole placche in un momento precedente l'infezione punto di post, Anche se lo stoccaggio sarebbe comunque richiedere la rimozione della sovrapposizione 8. Come cristal violetto può essere fatta semplicemente in una soluzione di acqua e alcol, e fornisce un elevato grado di sensibilità per la morfologia di placca mista, abbiamo scelto come un contatore macchia preferito e semplificato per il protocollo dimostrato come stiamo utilizzando diverse famiglie di ben virus caratterizzati.
Dopo aver sistemato e colorare il monostrato cellulare infetto, placche sono contati per poi titolare azionari campioni virali in termini di unità formanti placca (PFU) per millilitro. Una goccia registro deve essere osservata tra diluizioni seriali e, a seconda delle dimensioni piatto, tra 5-100 placche contati, con un controllo negativo utilizzato come riferimento. Campioni statisticamente possono variare del 10% per ogni 100 placche contati quando si confrontano campione replica 3. Il vantaggio di utilizzare saggi placca per determinare i titoli virali risiede nella loro capacità di quantificare il numero effettivo di particelle virali infettive well'ambito del campione. Come più virioni potrebbero potenzialmente infettare una singola cella, la terminologia di unità rispetto virons viene utilizzato durante titolazioni placca 1,2.
La morfologia della placca può variare notevolmente in condizioni di crescita differenti e tra le specie virali. Dimensione della placca, la chiarezza, la definizione dei bordi, e la distribuzione dovrebbero essere annotate in quanto possono fornire informazioni preziose sui fattori di crescita e di virulenza del virus in questione.
Principi di base del saggio di placca possono anche essere adattate e modificate in vari modi diversi, ad esempio nell'uso di focus formare saggi (FFA). FFAs non si basano su lisi cellulare e di contrasto per rilevare la formazione della placca, ma piuttosto impiegano tecniche per rilevare direttamente le proteine virali intracellulari mediante anticorpi marcati immunoistochimica. Aumento della sensibilità, riduzione tempi di incubazione dopo l'infezione, e, soprattutto, la capacità di quantificare i virus non-litici sono tutti distintivantaggi quando si impiegano FFAs. Mentre ampiamente utilizzati, i fattori critici limitanti in FFAs differenziano un saggio di placca tradizionale risiede nella necessità di anticorpi appropriati e la capacità di rilevarne solo subunità proteiche virali infettive rispetto virons attuale 4.
Ai fini di questo studio, ci limiteremo la nostra discussione di saggi placca classica e descrivere l'uso di strati solidi e semisolidi tradizionali (agarosio e CMC), insieme a nuovi liquido microcristalline sovrapposizioni di cellulosa.
Il fattore più critico per un saggio di placca successo risiede nella ottimizzazione del protocollo per la coltura virale specifico in questione come condizioni possono variare significativamente. Punti chiave da prendere in considerazione sono: ospitare la compatibilità cellulare con il virus in questione, adeguate condizioni di crescita virale, gli intervalli di diluizione sufficienti al fine di distinguere chiaramente placche, e la selezione di sovrapposizione corretta e colorazione per le cellule e virus in questione.
Mentre VeeV e RVFV sia crescere in condizioni molto simili utilizzando molti degli stessi tipi di cellula ospite, differenze di placca morfologia e cinetica di crescita variano notevolmente. Quando si utilizza cellule Vero per le prove di placca, che sono stati tradizionalmente utilizzati come una linea cellulare di propagazione e indicatore virus della febbre emorragica e alfavirus, VeeV cresce in genere a titoli più elevati rispetto RVFV e dimostra aumentato la cinetica di replica, lo sviluppo di placche di grandi dimensioni uniformi a 48 hpi 4, 10-12. In contrasto VeeV, RVFV richiede 72 hpi e dimostra placche che sono in genere molto più piccoli e di dimensioni variabili.
In opposizione a RVFV e VeeV, il virus dell'influenza è altamente cellula ospite specifico e può essere difficile da diffondere attraverso la cultura dei tessuti. Per il virus dell'influenza, l'ingresso del virus e la fusione è normalmente attivate dal legame del recettore sulla superficie cellulare con la glicoproteina virale hamagglutinin (HA), che media l'ingresso nella cellula bersaglio attraverso il legame con il recettore di superficie di acido α-sialico della cellula ospite. HA è una glicoproteina trimeric che è presente nella busta membrana di tutti i virus influenzali e richiede fenditura nella subunità HA1 e HA2 da una proteasi specifica cellula ospite. A complicare ulteriormente la questione, questi siti di rottura possono spesso variare tra i ceppi virali 13. In quanto espressione di proteasi capaci di scindere HA è limitato a specifici tessuti, proteasi are spesso aggiunto al mezzo di coltura per facilitare la fusione e l'ingresso del virus nella cellula ospite selezionata 13. TPCK-tripsina è un esempio di una proteasi di uso comune che viene utilizzato in colture cellulari sia MDCK e cellule Vero: agevolare replica multi-ciclo (in assenza di siero inattivare la tripsina) attraverso l'attivazione proteolitica di HA virale 14,15.
Come dimostrato in questo studio e di altri, le differenze di cicli di vita virali possono influenzare le selezioni di sovrapposizione, formati lastra, e dei tempi di incasso, con variazioni significative tra le classi diverse e specie di virus. Nel nostro studio, le sovrapposizioni di agarosio dimostrato placche più chiare a titoli più elevati rispetto sia CMC o sovrapposizioni liquidi sia per RVFV e virus dell'influenza B, rafforzando la sua utilità tra una vasta gamma di virus e tipi di cellule. Utilizzando una bassa concentrazione finale di agarosio grande aiuto nel rimuovere i tappi solidi e colorazione semplificata. CMC generale ha dimostrato la poorest efficacia come un overlay per tutti e tre i virus testati e prodotti molto piccoli e indistinti placche per il virus dell'influenza B. Anche se nel complesso CMC ha dimostrato le caratteristiche meno desiderabili, il suo uso in rapida crescita ed estremamente virulenti virus potrebbe rivelarsi vantaggiosa, come ha fatto apparire per ridurre le dimensioni della placca con solo una riduzione minima del titolo. La sovrapposizione del liquido si è rivelato il più versatile che era estremamente semplice da preparare, maggiore facilità di utilizzo, ed era paragonabile a agarosio su tutti i virus selezionati. In un formato piatto throughput più elevato a 96 pozzetti, l'applicazione e la rimozione non è stata inibita a causa di solidificazione come con sovrapposizioni tradizionali, e ha fornito risultati accurati e coerenti. Una considerazione quando si utilizza sovrapposizioni liquido sta nella colorazione opaca e l'incapacità di controllare la formazione della placca come le piastre non possono essere spostati fino al punto di raccolta, limitando questo adattamento per virus con una cinetica di replicazione precedentemente caratterizzati.
<pclass = "jove_content"> Le modifiche secondarie in condizioni di analisi della placca possono alterare significativamente i risultati, e la valutazione e le prestazioni di un nuovo sistema o tecnica è sempre garantito. Mentre un protocollo di test targa ottimizzato e standardizzato non esiste per ogni situazione, il nostro rapporto dimostra la versatilità e facilità d'uso in tradizionale così come overlay liquidi innovativi per analisi di placca, fornendo un'esperienza sufficiente per ulteriori modifiche da parte dell'utente.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |