Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
空斑试验仍然是最准确的方法,感染性病毒体和病毒物质,通过在细胞培养离散的斑(感染单位和蜂窝死区)的数量的直接定量之一。在这里,我们将演示如何执行基本斑块检测,以及不同的重叠和技术如何影响斑块的形成和生产。典型的固体或半固体覆盖基材,如琼脂糖或羧甲基纤维素,已被用来限制病毒的传播,通过所述液体生长培养基防止滥感染。固定覆盖限制蜂窝感染的直接围绕单层,从而允许离散可数的病灶和随后的斑块形成的形成。克服固有的使用传统覆盖的困难,一种新型的液体覆盖利用微晶纤维素和羧甲基纤维素钠已被越来越多地用作一个替换标准中空斑试验。液体覆盖斑块检测可以在任何标准的6或12孔板格式,可以容易地进行按传统工艺,不需要特殊的设备。由于其液体状态,并且随后的易于应用和去除的,微培养板格式可以备选地使用作为一种快速,准确和高吞吐量的替代较大规模的病毒滴定。使用非加热的粘稠液体聚合物提供了机会,以简化工作,节省试剂,孵化空间,并增加在传统或遏制高的实验室,因为没有试剂,加热或玻璃器皿中使用时的操作安全性是必需的。液体覆盖也可能被证明比传统的覆盖某些热不稳定的病毒更为敏感。
可行的病毒样本进行准确的分离和量化一直是病毒学正在进行的研究目标。直到斑块分析1952年问世的一种手段,以定性和定量计算出动物病毒滴度最早是1,2。这个技术首先适于与从噬菌体测定法,已预先用来计算在植物生物学1,2-库存噬菌体的效价修饰。而对于病毒定量的替代手段,至今已开发并适于,例如免疫测定,荧光和透射电子显微镜,可调电阻脉冲感测(TRPS),流式细胞术,重组报告系统,并定量逆转录聚合酶链反应(定量RT-PCR)的,这些方法不能识别和定量复制能力的病毒体1,3。而在技术和技术的进步不断完善和改变景观; plaquË试验继续代表在确定病毒浓度感染裂解病毒体1,4的黄金标准。
在一个噬斑分析,宿主细胞的汇合单层的感染未知浓度已连续稀释到一个可数的范围,典型地为5-100的病毒粒子之间的裂解病毒。受感染的细胞单层上覆盖在固定化覆盖介质,以防止病毒感染由通过液体介质的过程中病毒增殖或者机械或对流流动乱扩散。而固体或半固体覆盖,如琼脂糖,甲基纤维素或羧甲基纤维素(CMC),传统上一直使用的,液体的覆盖已成为具有新颖的液体覆盖的发展越来越有吸引力的替代,如微晶纤维素5- 7。利用液体与传统覆盖斑块检测有几个优势叠加可以APPL灭蝇灯在室温下,并施加和去除是显著容易。由于液体覆盖不需要暖,细腻,不耐热的病毒也可能被证明更容易牌匾。
初次感染和应用固定化叠加,个别斑块,或细胞死亡的区域之后,将开始发展为病毒感染和复制被限制到周围的单层。感染的细胞将继续复制裂解感染周期,进一步传播感染,导致越来越明显和离散斑。根据所使用的病毒的生长动力学和宿主细胞,可见斑块通常会在2-14天形成。细胞单层然后可以用标准的明视野显微镜,以便容易地识别斑块用肉眼进行计数,或者更典型地固定和counterstained通过中性红或晶体暴力。有各种各样的噬菌斑计数渍可用,每个发行日EIR特定的优点和缺点。结晶紫的加入量通常在收集点和覆盖层的固定/拆卸后,提供了一个快速的和独特计数器污点其允许非常小的噬斑中识别时的混合形态存在。中性红具有早期应用和与覆盖恒定接触的优点,允许在现场监测显影斑块形成,具有未知病毒或复制动力学工作时,这是特别有用的。然而,我们发现用中性红时染色通常不是作为不同的。 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)提供了几个优点,作为黄色染料染色活细胞的深蓝色和病毒噬斑可以不除去叠加的作为算用中性红。通过MTT,得到活细胞和死细胞之间的高对比度也允许小斑检测在较早的时间点在感染后虽然存储仍然需要去除覆盖8。结晶紫可以在水和醇中的溶液被简单地制成,并且提供了用于混合斑块形态灵敏度的高度,我们选择了它作为优选的和简化的计数器染色剂用于协议证明,因为我们正在利用几个家族的井病毒特征。
固定和染色被感染细胞单层后,噬菌斑计数,以滴定病毒原料样品中的噬斑形成单位(pfu)每毫升条款。日志下降应当注意连续稀释之间,并且根据板的大小,间5-100菌斑计数,以用作参照阴性对照。据统计样本将减少10%,每100斑块时,比较样品重复3计算各不相同。用空斑试验,以确定病毒滴度的优点在于它们的定量感染性病毒颗粒的实际数目瓦特能力ithin样品。作为多个病毒粒子有可能感染的单个的细胞中,单元与病毒体的术语是在斑块滴定1,2-使用。
斑块形态会发生很大不同下生长条件和病毒的物种之间。斑块大小,透明度,边框定义和分配都应该注意的,因为它们可以提供关于所讨论的病毒的生长和毒力因子的有价值的信息。
基本的空斑测定原理也可以被调整和修改在许多不同的方式,如在使用焦点形成测定(游离脂肪酸)的。游离脂肪酸不依赖于细胞裂解和复染以检测斑块形成,而是采用免疫染色技术来通过标记的抗体直接检测细胞内的病毒蛋白。增加的敏感性,降低的温育时间在感染后,最重要的是给定量的非裂解性病毒都是不同的能力使用时游离脂肪酸的优势。而被广泛使用的,关键限制因素在游离脂肪酸与传统的空斑测定出在需要适当的抗体并能够只用探针病毒蛋白亚单位与实际传染性病毒体4。
本研究的目的,我们将限制我们的讨论古典牌匾检测,并描述了使用传统固体和半固体覆盖(琼脂糖和CMC),随着新型液体微晶纤维素覆盖。
对于一个成功的噬斑测定中最关键的因素在于所述协议为特定病毒培养中的问题的优化作为条件可显著变化。重点要考虑到有:主机与病毒有关,合适的病毒生长的条件下,充分稀释范围的细胞相容性,为了明确区分斑块,并正确叠加选择和染色的细胞和病毒中的问题。
而VEEV和RVFV都采用了许多相同的宿主细胞类型中的非常类似的条件下生长,在斑块形态和生长动力学的差异而变化显著。当对空斑测定,其传统上被用作传播和指示细胞系对出血热病毒和甲病毒使用Vero细胞,VEEV通常生长到更高滴度比RVFV和演示增加的复制动力学,在48 HPI 4显影较大的均匀性斑块, 10 – 12。在对比的VEEV,RVFV要求72 HPI和演示斑块,通常要小得多,可变的尺寸。
在反对RVFV和VEEV,流感病毒是高度的宿主细胞特异性,并且很难通过组织培养繁殖。对于流感病毒,病毒进入和融合通过与病毒糖蛋白hamagglutinin(HA),它通过与宿主细胞的α-唾液酸表面受体结合介导进入靶细胞的细胞表面受体的结合通常被启动。 HA是三聚体糖蛋白,它存在于所有的流感病毒的膜包,并且需要切割进亚基HA1和HA2由一个特定的宿主细胞蛋白酶。为了进一步使问题复杂化,这些切割位点可病毒13株之间往往各不相同。作为能够裂解的HA被限制到特定的组织蛋白酶的表达,蛋白酶芳ë常常加到细胞培养基中,以促进病毒融合和进入所选宿主细胞中13。 TPCK胰蛋白酶是一种常用的蛋白酶是,用于在与两个MDCK和Vero细胞的细胞培养物的一个例子:通过病毒的HA 14,15的蛋白水解活化促进多循环复制(在不存在任何胰蛋白酶失活血清的)。
如本研究和其他人,在病毒生命周期的不同可以影响不同类和病毒物种间重叠的选择,盘格式和收集时间,以显著差异。在我们的研究中,琼脂糖覆盖层表现出在较高的滴度比任CMC或液体覆盖两个RVFV和乙型流感病毒更清晰的噬菌斑,补强之间广泛的病毒和细胞类型及其用途。用琼脂糖的低终浓度大大计算机辅助在去除固体塞和简化的染色。 CMC全面展示了Poorest功效的叠加层测试的所有三种病毒,并产生非常小的,模糊的斑块为乙型流感病毒。虽然整体CMC展示了最不理想的特点,其在快速增长的和极其致命的病毒可能会证明是有利的,因为它没有出现减少斑块大小与效价只有最小的减少使用。液体覆盖被证明是最通用的,因为它是非常简单的准备,增加易用性,并且是可比较的所有所选择的病毒的琼脂糖。在一个更高的吞吐量的96孔板格式,应用和除去没有因凝固抑制,与传统的叠加,并提供准确和一致的结果。用液体覆盖时的思考在于不透明颜色,而无法监视斑块的形成作为所述板不能移动,直到集合中的点,限制了这种适应的病毒与先前表征的复制动力学。
<p类=“jove_content”>在空斑试验条件稍作修改可以显著改变的结果,而任何新的系统或技术的评估和性能始终是必要的。而最优化和标准化的空斑检测协议不用于每一种情况存在,我们的报告表明的通用性和便于在传统的用途以及新型的液体覆盖对空斑测定,同时提供足够的背景为进一步的用户修改。The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |