İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.
Kas beslenme, egzersiz ve hastalık durumundaki değişikliklerle yanıt dinamik bir dokudur. Yaşı ve kas kitlesi ve işlevi kaybı, önemli bir halk sağlığı yükler bulunmaktadır. Şu anda hastalık ya da yaşla birlikte kas sağlık genetik düzenlenmesi hakkında biraz anlıyorum. Nematod C. elegans, ilgi duyulan biyolojik süreçlerin genomik düzenleme anlamak için belirlenmiş bir modeldir. Bu solucan vücut duvarı kasları yüksek metazoon türlerinin kasları ile homoloji geniş ölçüde görüntüler. C. elegans şeffaf bir organizma olduğu için, mitokondri ve sarkomer GFP yerelleştirme in vivo bu yapıların görülmesini sağlar. Benzer şekilde, hayvanların bir mitokondriyal membran potansiyeli varlığına dayalı birikir katyonik boyalar, beslenme, in vivo mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesini sağlar. Kas protein homeosta Bu yöntemler, hem de değerlendirmesis, kas performansı fonksiyonel önlemlerle alt-hücresel kusurlar arasında anlamlı bir ilişki sağlamak için, hareket deneyler şeklinde, bütün hayvanlar kas fonksiyonunun değerlendirilmesi ile birleştirilir. Böylece, C. elegans kas yapısı ve fonksiyonu üzerine mutasyonlar, gen demonte ve / veya kimyasal bileşiklerin etkisini değerlendirmek için güçlü bir platform sağlar. Son olarak, GFP, katyonik boyalar ve hareket deneyleri gibi değerlendirilir, non-invaziv, kas yapısı ve fonksiyonu prospektif çalışmalar tüm yaşam seyri boyunca yapılabilir ve şu anda bu kolayca başka bir organizmada in vivo araştırılması edilemez.
Kas iyi hareket, duruş desteği ve metabolizmasındaki rolü için takdir çok fonksiyonlu bir doku vardır. Sağlıklı kas gelişimi ve bakımı çok sayıda hücresel süreçleri ve bileşenlerinin koordinasyonunu gerektirir. Ya hasar veya hastalık nedeniyle, yanlış düzenlemenin değiştirilmiş kas yapısı ve / veya işlevi ile sonuçlanır oluşabilir. 1,2 kütle ve özellikle kas gücü ve dayanıklılığı 3-5 kas negatif mortalite ile ilişkilidir beri kas fonksiyonunda yaşa bağlı düşüş, batı dünyasında sağlık bütçelerine önemli bir yük sunuyor. Böyle değiştirilmiş mitokondriyal fonksiyon veya sarkomer bozulması gibi bozulan kas fonksiyonu ile ilgili yönleri, ölçüm genel kas gelişimi ve sağlığı destekleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.
Cı aenorhabditis elegans (C. elegans), mikroskopik bir nematodu bes olduğuonun tüm genom 6 dizilimi ilk çok hücreli organizma, RNAi 7 kullanılarak susturulmuştur genlere sahip ilk ve ilk olarak önerilmiştir, tüm hücre soyu 8 ve nöroanatomi 9 belirlenmiştir. C. elegans için tek metazoon çünkü t bilinir Sydney Brenner 10 tarafından 1974 yılında davranışın genetik kontrolü ve bunun önemi ve sonraki çalışma çalışma için model C. elegans araştırmacılara verilen üç Nobel Ödüllerinin ilk tanındı. C yaklaşık% 35 genler C. elegans kas gelişimi 11 genetik kontrolünü anlamak için kullanılan bir anahtar organizma olmak, insanlarda ortologlara belirledik elegans. Neredeyse C. elegans genom her gen RNAİ'nin 7,12 aşağı çaldı olabilir. Böylece, tam gelişmiş kas genleri aşağı vurma, genetik bileşenleri yeniden katkıdakas sağlığı gulation göreli basitliği 13 ile araştırılabilir.
RNAi, mutantlar ve kimyasal bileşiklerin kullanılması kombine yeteneği C. 16 yaş ve hastalık modellerinde 17 kas yapısı ve fonksiyonu genetik düzenlenmesini 7,14,15 keşfetmek için bir öncü sistem elegans yapar. Kas yapısı ve / veya işlevi üzerine kimyasal bileşiklere gen demonte, mutasyonu ve / veya maruz kalma etkisi çok yönlü olarak yoluyla ölçülebilir. Burada kısaca kas sağlık prospektif çalışmalarda kullanılabilecek çok olan C. elegans kas yapısını ve işlevini değerlendirmek için basit teknikleri anlatıyor.
Yeşil floresan protein geliştirme (GFP) 18 spesifik proteinlerin mevkiinde C. elegans organellerin genel yapısı, her iki görselleştirilmesini mümkün kılmıştır. Burada GFP speci ifade açıklaryöne- lik, gövde duvarı, kas mitokondri içinde, çekirdekler ya da sarkomer bu alt-hücresel yapıların distrofi mevcut olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Yapısı her zaman fonksiyonu için güvenilir bir vekil değil, biz de in vivo katyonik boyaların kullanımı kas içinde bozulmuş mitokondrial membran potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar açıklar. Boyalar GFP ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman, bunlar ömrü boyunca geçici bir şekilde mimari ve fonksiyon çalışma izin verir. Son olarak, aynı zamanda bu önlemlerin tüm hareket deneylerin kullanımı ile, bütün hayvanlar kas sağlığında değişiklikler belirlemek için kullanılabilir nasıl kas içinde protein homeostasisi değerlendirilebilir ve açıklar. Gen demonte, mutasyonları ve / veya kimyasal bileşikler ile birlikte bu teknikler, belirli bir gen ya da bileşikler, in vivo koşullarında, kas sağlığı üzerinde olumsuz etkileri ne çalışmak için güçlü bir cephanelik sağlar. C. elegans arasında yapısı, metabolizma ve kas brüt fonksiyonu paralelliklermemeliler C. elegans insanlar dahil yüksek organizmalarda, içinde kas düzenleme anlamak için olağanüstü bir model organizmadır demek.
Bu yöntemler, bir hareket bozukluğu neden olmak için yeterli olan alt-hücresel bozukluklarının belirlenmesi için hareket macrophysiology gelen kas keşfini sağlar. Kombine edildiğinde bu yöntemler kas ayrıntılı analizini sağlar. Kazanılan içgörü genel fizyoloji, patofizyoloji ve yaşlanma ilgilendirmeyen kas odaklı hipotezler ileri test sağlar.
Hareket Tahliller
Bir hareket kusur Normal konlar bir bozulma gösterir. Bu sinirlerin veya kas özgü olabilir veya çeşitli dokulardan arasında ortak olabilir. Tamamladıktan hareket testlerin en zor aşamaları nüfus ve / veya tedavinin temsilcisi olan solucanlar seçerek ve aynı zamanda deneyci M9 transfer üzerine hayvan zarar vermez garantiliyoruz. Bu hareketin bir temsilcisi ve doğru bir değerlendirme elde etmek için büyük bir örneklem büyüklüğü olması önemlidir. Yüksek kalem tahlil zamanÖrneğin etrant etkileri, sık sık mutantta görülmektedir, on hayvan bir örnek boyutu her hareket on kez değerlendirilen vahşi tip karşı istatistiksel olarak anlamlı fark için yeterlidir. Ancak, hareket deneyleri ve kültür C. elegans kolaylığı basitliği solucanlar yüzlerce hızlı kantitatif sonucu sağlamak amacıyla değerlendirilebilir anlamına gelir. Bir nüfusun yalnızca bir bölümünde mevcut görünür etkilerini tahlil zaman en çok etkilenen hayvanlarda defekt şiddeti yanı sıra etkilenmiş görünüyor nüfusun ne kadarının belirlemek önemlidir. Bu gibi durumlarda, hayvanların daha fazla sayıda etkilenen nüfus kısmı için çok az veri sağlamak üzere değerlendirilmelidir. Sıkça ilaç ve RNAi tedavileri hem nüfusun küçük bir bölümünde şiddetli hareketi kusurları üretecek. Bazı durumlarda Aff oranı artacak tedavisi ve ya da teslimat yöntemi dozunu arttırmakyansıtılmaktadır hayvan ve yürütülmesini doz tepki eğrileri, bir ilaç veya RNAi optimum yoğunluğunu belirlemek faydalı olabilir. Bu hareket, testin ikinci bir sınırlama solucan hareket değerlendirmek için manipüle olmasıdır. Bu nedenle, solucanlar hem uyarılmamış ve sıvı içinde aldı bir ozmotik basınç belli bir dereceye kadar tabi tutulmaktadır. Ozmotik basınç derecesi M9 veya Bu suya karşı tamponu 19 ile sınırlanabilir. Bu sınırlamalardan bazıları ImageJ 35 Piyasada mevcut izleme sistemleri 34 ya da ücretsiz eklentileri kullanarak plakalar üzerinde alışılmış hareketinin ölçülmesi ile hafifler. Bir hayvanın hareket hızını ölçme ömrü boyunca ölçülen ve bu yöntemin non-invaziv kas fonksiyonlarının prospektif ömür boyu çalışmalar için anahtar olabilir fonksiyonu değişiklikleri de dahil olmak üzere genel kas sağlığı ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir.
Kontraktil Aparatı Görüntüleme
<p class = "jove_content"> resim kasılma aparatı yapısı Burada kullanılan solucan suşu vücut duvarı kasları içinde sarkomer lokalize bir miyozin GFP füzyon proteinini ifade PJ727 36 oldu. Bu türün kullanımı, canlı hayvanlarda sarkomer yapısı görselleştirme sağlar. Yukarıda tarif edilen hareket tahliline benzer biçimde, sarkomer yapısını değerlendirmek GFP etiketli sarkomer kullanılmasının önemli bir avantajı, bu yöntem nispeten invazif olmayan ve bu nedenle ileriye ömrü boyunca, ayrı ayrı hayvanlar içinde sarkomer yapısını takip etmek için kullanılabilir olmasıdır. Bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler elde etmek için yapar, yine hareketli nedenle hayatta ve olmasıdır. Çeşitli yöntemler hareketini azaltmak ve daha basit görüntüleme yapmak için kullanılabilir; Bu anestezi veya basınç, emme ya da yüksek viskoziteli bir çözeltinin kullanımı ile solucanlar ve immobilizasyon felç vardır. Hareketsizleştirme Bu yöntemlerin her biritirme kendisi kas fonksiyonunu değiştirir gibi bir sakıncası vardır. Bu nedenle, bu analiz uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Ayrıca, seçilen bir hareketsizleştirme yöntemi, üzerinde çalışılmakta olan bir soru için ne kadar yaygın olarak kullanılan bağlı olarak, bağlı hareketsizleştirme yöntemi ile ilgili sorunlara yol sonuçları değildir teyit etmek için hareketsizleştirme en az iki bağımsız yöntemler kullanılması mantıklı bir çözüm olabilir. Burada azaltılmış hareketini başlatmak için solucanın üzerine lamel basit bir baskı kullandık. Lamel yerleştirdikten sonra, lamel altında sıvı buharlaşır ve lamel sonuç genellikle bu kolay görüntüleme sağlayacak kadar az hareket üretmek için 2-5 dakika sürer, solucanlar üzerinde daha fazla baskı üretmeye başlayacak.Lamel sonunda, co sonra genellikle 10-15 dk aşırı basınca gelen patlamaya solucanlar neden yeterli artacak basıncı girmiştir yakından sonra solucanları izlemek için esastırverslip ek. Ek tampon solucanlar ezilme yaralanmaları önlemek için lamel kenarlarında bir pipet ucu yardımıyla eklenebilir. Eğer istenirse bu, kapak kayma altında hayvanların alınmasını engelleyen, ancak Tırnak cilası, kapak kayma kenarlarını kapatırlar ve buharlaşmasını önlemek için de kullanılabilir. Benzer bir şekilde, çözelti içindeki silikon boncuk kullanımı basınç miktarını solucanlar üzerinde lamel yerleri azaltmaya yardımcı olabilir.
Sadece bir hareket kusuru için değerlendirilmesi gibi, bu etkinin penetransdır dikkate almak önemlidir. % 80-100 hayvanlar nüfus ekranın ≤20% bir etkiliyorsa 21-79% eksik ve düşük NGM plaka üzerinde bir fenotip göstermeyen eğer Penetransı yüksek kabul edilebilir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri sarkomer kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Etki ilaca yanıt olarak açık bir hareket bozukluğu ekran hayvan düşük penetrasyonun, seçim vardır durumlardaveya RNAi uygulama en çok etkilenen tedavi hayvanlarda sarkomer kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak, hareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynı olduğunu zorunlu bir durum değildir. Bu nedenle, örneğin, 100 hayvanların geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için arzu edilebilir. Bu, popülasyonda kusur dağılımının anlaşılmasını sağlar. Ayrıca en ağır etkilenen hayvanlarda kusurun derecesini incelemek ve / veya sarkomer kusur ölçüde ve hareket kusuru derecesi arasındaki ilişkiyi incelemek için istenebilir. Potansiyel zorluklar bir yana, bu yöntem sarkomer yapısı değerlendirilirken, diğer yöntemlere göre daha hızlı ve kolaydır. Bu hız ve kolaylığı, ancak, önemli bir sınırlamaya tabi olduğu, GFP füzyon proteinleri içeren sarkomer bozulduğu sarkomer 37 ve bu nedenle değerlendirme ilave daha emek-yoğun yöntemler kullanılarak teyit edilmelidir tamamen normal değildir.Bu yöntemler, 39 lekeleme falloidin polarize ışığın 38 kullanımını, ve dolaylı immünoflüoresans 40 içerir. Bu yöntemler arasında, ancak polarize ışık nispeten invazif olmayan olduğu; Diğer yöntemler tespiti gerektiren ve bu nedenle, ayrı ayrı hayvanlar arasında ileriye dönük çalışmalarda kullanılamaz, bunun yerine, sadece, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar teyit kesit geçmek için kullanılabilir.
Mitokondriyal Ağları Görüntüleme
Mitokondriyal görüntüleme deneyleri için kullanılan solucan soyu, gövde duvarı kaslarda ve, mitokondri ve çekirdekler lokalize bir GFP β-galaktosidaz füzyon proteini lokalize bir GFP füzyon proteinini tanımlayan CB5600 7 idi. Görüntüleme sarkomer için PJ727 kullanımı ile olduğu gibi, bu soyun kullanımı canlı hayvanlarda mitokondriyal ağ yapısı görselleştirme sağlar. Bu nedenle, bu suş örneğin, indirgenmiş mitocho oluşabilir, dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilirndrial füzyon ve / veya artan mitokondriyal füzyon 41. Ayrıca görüntüleme sarkomer gibi, bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler almak için yapma, hala canlı ve hareketli olmasıdır. Yukarıda daha detaylı olarak tartışıldığı gibi çeşitli yöntemler, hareketini azaltmak için kullanılabileceği halde, mitokondri indirgenmiş hareketinin endüklenmesi müdahaleler için özellikle hassas bir görünür. Örneğin, en yaygın mitokondriyal solunum zinciri anestezikler hedef bileşenleri kullanılır ve bu nedenle, normal mitokondriyal yapı ve fonksiyonu çalışmalarında dikkatle kullanılmalıdır edilir. En paralitik ajanlar daha az sinyal nöromüsküler kavşak ve kas fonksiyonel denervasyon geçmesine neden Benzer şekilde, çoğu paralitik ajanlar mitokondriyal parçalanma uyarmak için normal mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu çalışmaları dikkatle yeterlidir kullanılmalıdır. Bu çalışmada deneyler hayvan hareketsiz kılınması için baskı istihdamhemen görüntü hayvanlara gerekli olsa ler ama diğerleri başarıyla levamizolün 42 kullandık.
Son olarak, örneğin, B. subtilis için kültür çeşitli bakteryel kirletici maddeler arasında, mitokondriyal parçalanma uyarabilir; bu nedenle analizinde uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri mitokondriyal ağ kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mitokondriyal ağ küçük kusurlar yaygınlığı nedeniyle, bu hayvan az sayıda sarkomer yapısının değerlendirmesi için gereken iki kat fazla olması muhtemeldir. Etkisi düşük bir penetrasyonun sahip olduğu durumlarda, açık bir şekilde ilaç veya RNAi tedaviye yanıt olarak bir hareket bozukluğu gösteren hayvanların seçimi çoğu tedavi etkilenen hayvanların mitokondriyal kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, bu durum zorunlu değildirhareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynıdır. Bu nedenle, örneğin, 150-200 hayvanları, hem de en ağır enfekte olmuş hayvanların, bozulma derecesi ve kapsamı ile birlikte bozulma ölçüde varlığını veya yokluğunu geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için istenebilecektir hareket kusuru. Floresan etiketli mitokondri başka suşlar da CB5600 elde edilen sonuçları teyid etmek için kullanılabilir, ancak, farklı floresan proteinlerin kullanımı mitokondri taban ağ etkileyebilir. Örneğin, mitokondri görselleştirmek için bir tomm-20 TTT füzyon proteinin kullanımı ile mitokondriyal lokalize GFP 17 kullanımına karşı taban mitokondriyal parçalanma artmasına neden görünmektedir. Bu tür bağışıklık ve elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler mitokondriyal yapısını değerlendirmek için kullanılabilecek olmakla birlikte, bir katılaştırma basamağı gerektirir çünkü onlar mitokondriyal dinamikleri in vivo değerlendirme izin vermezd. Gibi mitokondriyal lokalize boyaların kullanılması gibi başka yöntemler tespit olmadan da kullanılabilir ve bu nedenle, aynı zamanda mitokondriyal lokalize GFP kullanım yerine kullanılabilir. Bir sonraki bölümde tartışıldığı gibi, bu tür boyaların kullanımı, aynı zamanda in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun ham değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.
C. elegans In Vivo Mitokondriyal Membran Potansiyelini Değerlendirme
Boyaların çeşitli etiketleme mitokondri 28 için kullanılabilir. Bu boyalar, canlı C. elegans içinde mitokondriyal ağ yapısı görselleştirmek için alternatif bir yöntem sağlar. Onlar mitokondriyal membran potansiyeli dayalı mitokondri içinde birikir, çünkü bu boyaların çoğu aynı zamanda in vivo mitokondriyal işlevsellik ham değerlendirmesini sağlar. Yoluyla yutulur Burada biz kullandık C 32 H 32 Cl 2 N 2 OBazı ek nedeniyle% 0.5 DMSO içinde çözülerek elde geçirgenliği üst deri yoluyla solucan girerek sindirim sistemi. Hücrenin C 32 H 32 Cl 2 N 2 O içine girmesinin ardından oksitlenmiş ve amino asitler (örn metiyonin ve sistein) sülfür içeren bağlar mitokondri tarafından tecrit edilir. Bu boya-peptid komplekslerinin oluşumu, H 32 CI2 N2 O kez 28 etiketli mitokondri kalır Cı 32 anlamına gelir. Mitokondriyal boya maddelerinin kullanılması ile önemli bir zorluk ve hayvanın tüm mitokondri etiket olmasıdır. Bu nedenle CB5600, kas mitokondriyal ağ yapısı değerlendirilmesi için, yukarıda tarif edilen aynı suşunda etiketleme gerçekleştirdik. Kırmızı mitokondriyal boya, kas mitokondrilerinde, GFP ifade solucanlar bir yük ve üç geçişli bir filtre kullanarak, görüntü olan mitokondri O bularak kas sadece mitokondri nispeten basittirkırmızı boya ve GFP etiketli mitokondri ko tarafından aralığı. Boya fotoğraf ağartılmış yüksek yoğunluklu floresan ışığı altında saniye içinde olduğundan bu ko yaklaşımı yapılmasında en zor adım görüntüleme olduğunu. Bu etki deneyi görüntü hazır oluncaya kadar düşük güç floresan tutulması ve daha sonra buna göre floresans yoğunluğu ayarlanarak sınırlanabilir. Bir boya maddelerinin kullanılması ile tecrübe sonra başka bir yaklaşımı, doğru doku görüntü yalnızca mitokondrilerde Z-bacalara konfokal mikroskopi kullanmaktır; kas mitokondriyal şebekeler diğer dokulara kıyasla oldukça farklıdır. Ne yazık ki, mitokondri 28 terk C 32 yetersizlik, H 32 CI2 N2 O sarkomer ve mitokondriyal görüntüleme teknikleri, yukarıda tartışılan farklı olarak, ileriye yönelik olarak, H, 32 derecede 32 sürece, zamanla mitokondriyal fonksiyonun kaybı takip kullanılamaz anlamına gelir CI2 N2 OHayvan popülasyonlarının ayrı ayrı zaman noktalarında ilave edilir. Bu sınırlama gibi 43 potansiyel membranın yıkılmasından sonra mitokondri terk ediyor JC-10 gibi boyalar kullanılarak aşılabilir. Mitokondri, aynı zamanda C ile izole edilebilir sonraki biyokimyasal analizler için elegans 30. Bu ekstre, akış sitometrisi kullanılarak lipofilik katiyonik boya alımı veya bir fluoresan plaka okuyucusu 44 oranını nicelleştirilmesiyle mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü sağlar. Bozulmuş mitokondriyal membran potansiyelinin kurulmuş olması, proton degrade kaybı hassas bioluminometric lusiferaz tabanlı bir metot kullanılarak 45 ATP üretimi kaybı anlamına olmadığını belirlemek de mümkündür.
C. Protein Parçalanabilme değerlendirilmesi elegans
Kas protein parçalanmasını değerlendirmek için burada kullanılan solucan türü, bir kas belirli bir β içeren PD55 olduyetişkinlik ulaştı ve sonraki 72-96 saat 19 sitosolde stabil kaldığı kadar galaktosidaz olduğunu sürekli gelişimi boyunca sentezlenir. Yetişkinlik döneminde β-galaktosidaz kaybı müdahale sitosolik protein degradasyonunu 19 artmıştır tetiklendi gösterir ise Bu durumda, gelişme sırasında β-galaktosidaz seviyeleri ölçümü ağırlıklı miyozin yükselticiden sentezi üzerindeki müdahalelerin etkisini gösterir. Β-galaktosidaz aktivitesini belirlemede önemli safhalı ve etkili bir kurumaya sağlamaktır. Etkin hayvanlar kurutulması için başarısızlık hayvanların vücut duvarı kasları X-gal alt-tabaka ve bu nedenle zayıf mavi rengin zayıf sağlanması ile sonuçlanır. Desikatörde üzerindeki mühür kontrol edilmeli ve örnek ilerlemeyi değerlendirmek üzere kuruma boyunca 5-10 dk aralıklarla kontrol edilmelidir iyi kuruma sağlamak için (yani, 20 ul numune 10 dakika ve kalan 20 dakika içinde kurutulmuş olmalıdır) kapsamlı kurumaya sağlamaktır. Β-galaktosidaz deneyi bir aktivite deneyi, bu nedenle, uygun bir kontrol kaçınılmazdır. Buna ek olarak, bu bozunma meydana ispat olmayan kontrol etmek için bir işlem koşulu, göreceli olarak yetişkin azaltılmış lekeleme sağlar; bunun yerine tedaviye tepki olarak enzimatik aktivitesi azalma gösterir. Bozulmayı teyit etmek için, daha fazla emek-yoğun Western Blot analizi β-galaktosıdaz 13 karşı tamamlandı ve bu sayılan solucanlar küçük popülasyonlarında miktar protein parçalanmasını sağlar edilmelidir. Western Blot bant yoğunlukları ImageJ 46 kullanılarak belirlenebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama transjenik proteinlerin kullanımı bozulmasının fizyolojik hedefleri olarak ve proteomik ve / veya hedeflenen hipotez tahrik western blotları 13 kullanılması gerekmektedir Bu tür yanıtlar için bilgi olmamasıdır. Son olarak, bu çalışmalarda transgenik protein sentezi gibi erken yetişkinlik 19 kapanıyor </sup> tam gelişmiş C kas protein sentezinde değişiklikler incelemek isteyen zaman, diğer yöntemler kullanılması gerektiği kas elegans; Örneğin, buradaki dengeli veya radyoaktif izotop yöntemleri.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |