العضلات الهيكلية هي ضرورية للتنقل وتخزين البروتين الرئيسي هي الهيئات. ووصف القياسات الصحية العضلات داخل C. ايليجانس. ويتم تقييم التغيرات المحتملة في بنية العضلات وظيفة باستخدام GFP المحلية والأصباغ الموجبة.
العضلات هي الأنسجة الحيوية التي تستجيب للتغيرات في التغذية، وممارسة، ودولة المرض. فقدان كتلة العضلات ووظيفتها مع المرض والعمر والصحة العامة أعباء كبيرة. ونحن نفهم حاليا سوى القليل عن التنظيم الجيني للصحة العضلات مع المرض أو التقدم في السن. الديدان الخيطية C. ايليجانس هو نموذج أنشئت لفهم التنظيم الجينومي من العمليات البيولوجية من الفائدة. عضلات جدار الجسم هذه الدودة تعرض على درجة كبيرة من التماثل مع عضلات الأنواع metazoan أعلى. منذ C. ايليجانس هو كائن شفاف، وتوطين GFP إلى الميتوكوندريا وsarcomeres يسمح التصور من هذه الهياكل في الجسم الحي. وبالمثل، تغذية الحيوانات الأصباغ الموجبة، والتي تتراكم على أساس وجود إمكانات غشاء الميتوكوندريا، يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي. هذه الأساليب، فضلا عن تقييم بروتين العضلات homeostaجهاز الأمن والمخابرات، وجنبا إلى جنب مع تقييم وظيفة عضلة الحيوان كله، في شكل المقايسات حركة، للسماح للارتباط العيوب شبه الخلوية مع الإجراءات الوظيفية للأداء العضلات. وبالتالي، توفر جيم ايليجانس منصة قوية التي لتقييم تأثير الطفرات، ضربة قاضية الجينات، و / أو المركبات الكيميائية على بنية العضلات وظيفة. وأخيرا، كما GFP، والأصباغ الموجبة، والمقايسات حركة يتم تقييم غير جراحية، ويمكن إجراء الدراسات المستقبلية من بنية العضلات وظيفة عبر مسار الحياة وهذا كله في الوقت الحاضر لا يمكن تحقيق بسهولة في الجسم الحي في أي كائن آخر.
العضلات هي الأنسجة المتعددة الوظائف، عن تقديره جيدا لدورها في الحركة ودعم وضع الجسم والتمثيل الغذائي. تطوير وصيانة العضلات صحية تتطلب تنسيق العمليات والمكونات الخلوية متعددة. إما من خلال الضرر أو المرض، يمكن أن تحدث التقلبات، مما أدى إلى تغير بنية العضلات و / أو وظيفة. الانخفاض المرتبط بالعمر في وظيفة العضلات يمثل عبئا كبيرا على ميزانيات الرعاية الصحية في العالم الغربي، لأن العضلات 1،2 وخاصة القوة العضلية والتحمل 3-5 ويرتبط سلبا مع فيات. قياس الجوانب المتعلقة تدهور وظيفة العضلات مثل وظيفة الميتوكوندريا تغييرها أو تعطيل قسيم عضلي، يمكن أن تسمح فهم أعمق للآليات التي تقوم عليها تنمية العضلات والصحة العامة.
ايليجانس C aenorhabditis (C. ايليجانس) هو بيز الخيطية المجهريةر معروف لأنه كان أول متعددة الخلايا أن يكون الجينوم بأكمله التسلسل 6، الأولى لإسكات الجينات باستخدام رني 7، وmetazoan الوحيد الذي لديه كامل النسب خلية 8 و 9 التشريح العصبي تحديدها. C. ايليجانس من كان أول من اقترح كما وقد اعترف نموذجا للدراسة وراثية تحكم السلوك في عام 1974 من قبل سيدني برينر (10) وأهمية هذا العمل واللاحقة مع أول ثلاثة جوائز نوبل التي منحت لC. ايليجانس الباحثين. حوالي 35٪ من جيم ايليجانس وقد حددت الجينات orthologues في البشر، مع C. ايليجانس كونها كائن الرئيسية المستخدمة لفهم السيطرة الوراثية للتنمية العضلات 11. تقريبا كل الجينات في جينوم C. ايليجانس يمكن ترسيتها خلال رني 7،12. وبالتالي، من خلال هدمت الجينات في عضلة تطويره بالكامل، العناصر الوراثية التي تسهم في إعادةgulation الصحة العضلات يمكن التحقيق مع البساطة النسبية 13.
القدرة مجتمعة لاستخدام رني، المسوخ، والمركبات الكيميائية تجعل C. ايليجانس نظام رئيس الوزراء لاستكشاف التنظيم الجيني 7،14،15 من بنية العضلات وظيفة مع التقدم في العمر 16 و 17 في نماذج المرض. ويمكن قياس تأثير ضربة قاضية الجينات، الطفرة، و / أو التعرض للمركبات الكيميائية على بنية العضلات و / أو وظيفة من خلال جوانب متعددة. نحن هنا وصف موجز تقنيات بسيطة لتقييم C. هيكل ايليجانس العضلات وظيفة، وكثير منها يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية للصحة العضلات.
وقد مكن تطوير بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 18 التصور كل محلة بروتينات محددة والهيكل العام للعضيات في C. ايليجانس. نحن هنا شرح كيفية أعرب GFP SPECIfically داخل الجسم الميتوكوندريا العضلات الجدار، نوى، أو sarcomeres يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان الضمور هذه الهياكل الفرعية الخلوية موجودا. كما هيكل ليس دائما بديل موثوق به لوظيفة، كيف نفسر أيضا استخدام الأصباغ الموجبة في الجسم الحي يسمح بتقييم ضعف إمكانات غشاء الميتوكوندريا داخل العضلات. عندما تستخدم الأصباغ في تركيبة مع GFP، فإنها تسمح دراسة الهندسة المعمارية وظيفة بطريقة الزمنية طوال العمر. وأخيرا، فإننا شرح أيضا كيف توازن البروتين داخل العضلات ويمكن تقييم وكيف أن كل هذه التدابير يمكن أن تستخدم لربط التغيرات في عضلة الصحة الحيوانية كلها عن طريق استخدام المقايسات الحركة. هذه التقنيات، جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية الجينات، والطفرات، و / أو المركبات الكيميائية وتوفر ترسانة قوية لدراسة كيف يمكن للجينات أو مركبات معينة تؤثر على صحة العضلات في الجسم الحي. أوجه التشابه في الهيكل، والتمثيل الغذائي وظيفة جسيمة لعضلة بين C. ايليجانس والثدييات يعني C. ايليجانس هو كائن نموذجا بارزا لفهم تنظيم العضلة في الكائنات العليا، بما في ذلك البشر.
هذه الأساليب تتيح استكشاف العضلات من macrophysiology الحركة لتحديد العيوب التحت خلوية التي هي كافية للتسبب في خلل الحركة. عند الجمع بين هذه الأساليب تسمح بتحليل مفصل من العضلات. البصيرة المكتسبة تتيح إجراء مزيد من التجارب من الفرضيات الموجهة العضلات التي تتعلق الفيزيولوجيا العامة، الفيزيولوجيا المرضية والشيخوخة.
حركة فحوصات
هناك خلل الحركة يشير إلى اختلال وظيفة العصبية والعضلية العادية. قد يكون هذا محدد لالأعصاب أو العضلات أو أنها قد تكون مشتركة بين عدة الأنسجة. المراحل الأكثر صعوبة استكمال فحوصات الحركة هي التي تختار الديدان التي تكون ممثلة للسكان و / أو العلاج، وضمان أيضا أن المجرب لا تجرح الحيوان عقب نقله إلى M9. من المهم أن يكون حجم العينة كبير للحصول على تقييم تمثيلي ودقيق للحركة. عندما يعاير غاية القلمآثار etrant، على سبيل المثال ينظر إليها في كثير من الأحيان في المسوخ، وحجم عينة من عشرة حيوانات لتقييم كل حركة عشر مرات غير كافية لإيجاد فروق ذات دلالة إحصائية في مقابل من النوع البري. ومع ذلك، فإن البساطة من فحوصات الحركة وسهولة زراعة C. ايليجانس يعني أن مئات من الديدان يمكن بسرعة تقييمها من أجل ضمان تحقيق نتائج قوية من الناحية الكمية. عندما يعاير الآثار التي تظهر في الوقت الحاضر سوى جزء من السكان من المهم لتحديد ما هي نسبة السكان يظهر أن تتأثر، فضلا عن شدة خلل في الحيوانات الأكثر تضررا. في مثل هذه الحالات ينبغي تقييم أعداد أكبر من الحيوانات من أجل توفير البيانات الحد الأدنى لنسبة السكان المتضررين. في كثير من الأحيان على حد سواء المخدرات والعلاجات رني سينتج العيوب حركة حادة في نسبة صغيرة من السكان. في بعض الحالات زيادة جرعة العلاج وأو طريقة التسليم وزيادة نسبة قسم الشؤون الماليةقد تكون الحيوانات ECTED ومنحنيات الاستجابة للجرعة تشغيل مفيدا في تحديد تركيز الأمثل للدواء أو رني. والقيد الثاني من هذه الحركة الفحص هو أن الديدان يتم التلاعب في تقييم الحركة. وبالتالي، فإن الديدان وكلاهما حفز وتعرض لبعض الضغط الاسموزي درجة عندما تلقى في السائل. درجة الضغط الاسموزي يمكن أن يقتصر باستخدام M9 أو BU عازلة 19 بدلا من الماء. والتخفيف من بعض هذه القيود من خلال قياس حركة المعتادة على لوحات باستخدام نظم تتبع المتاحة تجاريا 34 أو المكونات الإضافية المجانية ليماغيج 35. ويمكن قياس معدل الحركة حيوان توفير المعلومات الهامة المتعلقة بالصحة العامة العضلات، بما في ذلك التغيرات في وظيفة التي يمكن قياسها في مختلف مراحل العمر وغير الغازية من هذه الطريقة هو المفتاح لدراسات مدى الحياة المتوقعة من وظيفة العضلات.
التصوير من جهاز مقلص
<كان ع الطبقة = "jove_content"> سلالة دودة تستخدم هنا لهيكل الجهاز صورة مقلص PJ727 36 الذي يعبر عن انصهار بروتين الميوسين GFP أن يكون موضعيا لsarcomeres داخل عضلات جدار الجسم. استخدام هذه السلالة يمكن تصور هيكل قسيم عضلي في الحيوانات الحية. على غرار فحص الحركة المذكورة أعلاه، والميزة الرئيسية لاستخدام GFP المسمى sarcomeres لتقييم هيكل قسيم عضلي هو أن الأسلوب هو نسبيا غير الغازية، وبالتالي يمكن استخدامها لمتابعة مستقبلي هيكل قسيم عضلي في الحيوانات الفردية في مختلف مراحل العمر. أكبر صعوبة مع هذا الأسلوب هو أن الديدان التي يجري تصويرها لا تزال على قيد الحياة، وبالتالي تتحرك، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ركز جيدا. يمكن استخدام العديد من الطرق للحد من الحركة وجعل التصوير أسهل. وتشمل هذه التخدير أو شل الديدان والشلل عن طريق الضغط والشفط، أو استخدام محلول اللزوجة العالية. كل من هذه الأساليب من immobilizأوجه ديه عيب أنه يمكن أن يغير نفسه وظيفة العصبية والعضلية. ولذا، فمن الضروري أن تشمل ضوابط غير المعالجة المناسبة في التحليل. كما قد يكون من الحكمة أن تستخدم اثنين على الأقل من وسائل مستقلة للتجميد لتأكيد النتائج ليست بسبب مشاكل مع أسلوب تجميد، وهذا يتوقف على كيفية استخدامها على نطاق واسع طريقة تجميد المختار هو المسألة قيد الدراسة. نحن هنا قد استخدمت ضغط بسيط من ساترة على دودة للحث على انخفاض الحركة. بعد وضع ساترة، فإن السائل تحت ساترة تتبخر وبالتالي سوف تبدأ ساترة لإنتاج المزيد من الضغوط على الديدان، وهذا يستغرق عادة 2-5 دقيقة إلى انخفاض إنتاج ما يكفي من الحركة لتمكين التصوير سهلا.فمن الضروري لمراقبة عن كثب الديدان بعد أن تم عرضه ساترة مثل الضغط سيزيد في نهاية المطاف بما يكفي للتسبب الديدان أن تنفجر من الضغط المفرط، وعادة 10-15 دقيقة بعد التعاونبالإضافة verslip. ويمكن إدخال عازلة إضافية مع المعونة من طرف الماصة حول حواف ساترة لتجنب الاصابة لسحق الديدان. طلاء الأظافر يمكن أن تستخدم لختم حواف الغطاء زلة ومنع التبخر، على الرغم من أن هذا يمنع استرجاع الحيوانات من تحت الغطاء زلة، إذا رغبت في ذلك. وبالمثل، يمكن استخدام الخرز سيليكون في حل يساعد على التقليل من كمية الضغط الأماكن ساترة على الديدان.
كما هو الحال مع تقييم لعيب الحركة، فمن المهم النظر في انتفاذ من التأثير. ويمكن اعتبار انتفاذ عالية إذا عرض 80-100٪ من الحيوانات النمط الظاهري على لوحة NGM، جزئيا إذا 21-79٪ ومنخفضة إذا ≤20٪ من السكان على شاشة تؤثر. لآثار توغل للغاية، أحجام العينات الصغيرة يمكن استخدامها لإنتاج بيانات كمية كبيرة على عيوب قسيم عضلي. في الحالات التي يكون فيها أثر له انتفاذ المنخفض، واختيار الحيوانات التي تعرض وجود خلل واضح في الحركة ردا على المخدراتأو قد يكون مفيدا في علاج رني معايرة العيوب قسيم عضلي في الحيوانات الأكثر تضررا من العلاج. ومع ذلك، فإنه ليس بالضرورة أن مدى تأثير العلاج على الحركة والبنية التحت خلوية هو نفسه. وبالتالي، قد يكون من المرغوب فيه للنظر في مدى العيوب الموجودة في عدد كبير من السكان، على سبيل المثال 100 الحيوانات. وهذا يتيح فهم توزيع العيوب طوال السكان. قد يكون من المستحسن أيضا لدراسة مدى الخلل في الحيوانات الأكثر تضررا و / أو فحص العلاقة بين مدى الخلل قسيم عضلي ومدى خلل الحركة. الصعوبات المحتملة جانبا، وهذه الطريقة أسرع وأسهل من الطرق الأخرى لتقييم هيكل قسيم عضلي. هذه السرعة وسهولة، مع ذلك، تخضع لقيود الرئيسيين، sarcomeres تحتوي على البروتينات الانصهار GFP ليست طبيعية تماما وينبغي تأكيد 37 وبالتالي تقييم sarcomeres تعطلت باستخدام أساليب كثيفة العمالة أكثر إضافية.وتشمل هذه الطرق استخدام الضوء المستقطب 38، تلطيخ phalloidin 39، والتألق المناعي غير المباشر 40. من هذه الأساليب، الضوء المستقطب فقط هو نسبيا غير الغازية. طرق أخرى تتطلب تثبيت، وبالتالي لا يمكن استخدامها في الدراسات المستقبلية من الحيوانات الفردية، بل يمكن أن تستخدم إلا للتأكيد، عبر sectionally، والنتائج من هذه الدراسات.
التصوير شبكات الميتوكوندريا
كانت سلالة دودة تستخدم للتجارب التصوير الميتوكوندريا CB5600 7 الذي يعبر عن البروتين GFP الانصهار مترجمة إلى الميتوكوندريا وGFP β غالاكتوزيداز البروتين الانصهار مترجمة إلى نوى، سواء في عضلات جدار الجسم. كما هو الحال مع استخدام PJ727 لsarcomeres التصوير، واستخدام هذه السلالة يمكن تصور بنية شبكة الميتوكوندريا في الحيوانات الحية. وبالتالي، هذه السلالة يمكن استخدامها لتقييم التغيرات الديناميكية التي تحدث، على سبيل المثال خفض mitochoالانصهار ndrial و / أو زيادة الانشطار الميتوكوندريا 41. أيضا لsarcomeres التصوير، وأعظم صعوبة مع هذا الأسلوب هو أن الديدان التي يجري تصويرها لا تزال حية ومؤثرة، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ركز جيدا. في حين أن العديد من الطرق، كما نوقش بمزيد من التفصيل أعلاه، يمكن استخدامها للحد من الحركة، والميتوكوندريا تظهر حساسية خاصة للتدخلات التي تحفز على انخفاض الحركة. على سبيل المثال، الأكثر استخداما مكونات التخدير الهدف من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا، وبالتالي يجب أن تستخدم بحذر في دراسات هيكل الميتوكوندريا العادي وظيفة. وبالمثل، يجب استخدام معظم وكلاء مشلول بحذر في دراسات هيكل الميتوكوندريا العادي وظيفة، كما تسبب معظم وكلاء مشلول أقل إشارة بالمرور عبر تقاطع الاعصاب وإزالة التعصيب الوظيفي للعضلات وكافية لإحداث تجزئة الميتوكوندريا. التجارب في هذه الدراسة استخدمت الضغط لشل حركة الحيواناتS ولكن البعض الآخر قد استخدمت بنجاح الليفاميزول 42، على الرغم من أنه من الضروري للحيوانات الصورة على الفور.
أخيرا، والملوثات البكتيرية المختلفة في الثقافات، على سبيل المثال B. الرقيقة، يمكن أن تحدث تجزئة الميتوكوندريا. ولذا فمن الضروري أن تشمل ضوابط غير المعالجة المناسبة في التحليل. لآثار توغل للغاية، أحجام العينات الصغيرة يمكن استخدامها لإنتاج بيانات كمية كبيرة على عيوب شبكة الميتوكوندريا. ولكن نظرا لانتشار العيوب الطفيفة في شبكة الميتوكوندريا، وهذا عدد قليل من الحيوانات من المرجح أن يكون ضعف العدد المطلوب لتقييم هيكل قسيم عضلي. في الحالات التي يكون فيها أثر له انتفاذ المنخفض، واختيار الحيوانات التي تظهر بوضوح وجود خلل الحركة ردا على المخدرات أو المعاملة رني قد تكون مفيدة في معايرة عيوب الميتوكوندريا في الحيوانات الأكثر تضررا من العلاج. لكن، وكما ذكر أعلاه، فإنه ليس بالضرورة أنمدى تأثير العلاج على الحركة والبنية التحت خلوية هو نفسه. وبالتالي، قد يكون من المرغوب فيه للنظر في مدى العيوب الموجودة في عدد كبير من السكان، على سبيل المثال 150-200 الحيوانات، فضلا عن مدى اضطراب في الأكثر تضررا الحيوانات ووجود أو عدم وجود قدر من التعطيل مع مدى خلل الحركة. سلالات أخرى مع fluorescently المسمى الميتوكوندريا يمكن استخدامها لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها في CB5600، ومع ذلك، فإن استخدام البروتينات الفلورية مختلفة يمكن أن تؤثر على الشبكات الأساسية من الميتوكوندريا. على سبيل المثال، يظهر استخدام TOMM 20 RFP البروتين الانصهار لتصور الميتوكوندريا لتسبب زيادة تجزئة الميتوكوندريا خط الأساس مقابل استخدام GFP محلية mitochondrially 17. في حين أساليب أخرى مثل المناعي والمجهر الإلكتروني يمكن استخدامها لتقييم هيكل الميتوكوندريا، فإنها لا تسمح للتقييم في الجسم الحي من ديناميات الميتوكوندريا بسبب خطوة التثبيت هو مطلوبد. طرق أخرى مثل استخدام الأصباغ المحلية mitochondrially يمكن استخدامها دون تثبيت، وبالتالي يمكن أن تستخدم أيضا في مكان استخدام GFP محلية mitochondrially. كما نوقش في القسم التالي، واستخدام هذه الأصباغ كما يسمح بتقييم الخام في الجسم الحي وظيفة الميتوكوندريا.
تقييم غشاء الميتوكوندريا المحتملة في فيفو في C. ايليجانس
تتوفر لوضع العلامات الميتوكوندريا 28 مجموعة متنوعة من الأصباغ. توفر هذه الأصباغ طريقة بديلة لتصور هيكل الشبكة الميتوكوندريا في C. ايليجانس الحية. العديد من هذه الأصباغ أيضا السماح تقييم الخام وظائف الميتوكوندريا في الجسم الحي لأنها تتراكم في الميتوكوندريا استنادا إلى إمكانات غشاء الميتوكوندريا. نحن هنا قد استخدمت C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O التي يتم تناولها من خلالالجهاز الهضمي، مع دخول بعض بالإضافة إلى الدودة عبر بشرة بسبب permeabilization التي يوفرها يجري حله في DMSO 0.5٪. بعد دخول الخلية C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O يتأكسد والمحتجزين من قبل الميتوكوندريا حيث يربط الكبريت التي تحتوي على الأحماض الأمينية (مثل الميثيونين والسيستين). تشكيل هذه المجمعات صبغ يعني الببتيد C 32 H 32 N 2 الكلورين 2 O يبقى في الميتوكوندريا مرة واحدة وصفت 28. وهناك مشكلة رئيسية مع استخدام الأصباغ الميتوكوندريا هي أنهم سوف تسمية كل الميتوكوندريا في الحيوان. لذا قمنا بإجراء وضع العلامات في CB5600، نفس السلالة المذكورة أعلاه لتقييم عضلة هيكلية شبكة الميتوكوندريا. باستخدام صبغة حمراء الميتوكوندريا، وهو سلالة من الديدان معربا عن GFP في الميتوكوندريا العضلات، وتمرير مرشح الثلاثي، بل هو بسيط نسبيا لصورة الميتوكوندريا فقط في العضلات من خلال إيجاد الميتوكوندريا التي هي سمجموعة من قبل colocalization من صبغة حمراء والميتوكوندريا GFP المسمى. الخطوة الأكثر صعوبة في أداء هذا النهج colocalization هي التصوير بسبب الصبغة هو في غضون ثوان تحت كثافة عالية ضوء الفلورسنت-ابيض صور. هذا التأثير يمكن أن يقتصر طريق الحفاظ على مضان على طاقة منخفضة حتى المجرب جاهز لصورة ومن ثم تعديل كثافة مضان وفقا لذلك. بمجرد شهدت واحدة مع استخدام الأصباغ نهج آخر هو استخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع Z-مداخن لصورة الميتوكوندريا فقط في الأنسجة اليمنى. شبكات الميتوكوندريا في العضلات تختلف تماما بالمقارنة مع الأنسجة الأخرى. للأسف، عجز C 32 H 32 الكلورين 2 N 2 O لمغادرة الميتوكوندريا 28 تعني أنه، على خلاف التقنيات قسيم عضلي والتصوير الميتوكوندريا التي نوقشت أعلاه، فإنه لا يمكن أن تستخدم لمتابعة مستقبلي فقدان وظيفة الميتوكوندريا مع مرور الوقت، إلا إذا C 32 H 32 CL 2 N 2 Oوأضاف في نقاط زمنية منفصلة لفصل السكان الحيوان. هذا القيد يمكن التغلب عليها باستخدام الأصباغ مثل JC-10 التي لا تترك الميتوكوندريا على انهيار محتمل غشاء 43. الميتوكوندريا ويمكن أيضا أن تكون معزولة من C. ايليجانس 30 للتحاليل الكيميائية الحيوية اللاحقة. هذا الاستخلاص الكمي يسمح للإمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس معدل امتصاص دهون الموجبة الصبغة باستخدام التدفق الخلوي أو قارئ لوحة فلوري 44. بعد أن أنشأ ضعف إمكانات غشاء الميتوكوندريا، فمن الممكن أيضا تحديد ما إذا كان فقدان بروتون التدرج يترجم إلى فقدان إنتاج ATP باستخدام طريقة bioluminometric القائم luciferase المراسل حساس 45.
تقييم تدهور البروتين في C. ايليجانس
كانت سلالة دودة تستخدم هنا لتقييم تدهور البروتين في العضلات PD55، والتي تحتوي على β محدد العضلات-galactosidase أن يتم تصنيعه بشكل مستمر طوال تنمية حتى يتم التوصل إلى مرحلة البلوغ والتي لا تزال مستقرة في العصارة الخلوية في 72-96 ساعة القادمة 19. وبالتالي، وقياس مستويات β غالاكتوزيداز خلال تنمية تشير في الغالب تأثير التدخلات على التوليف من المروج ميوسين في حين أن فقدان β غالاكتوزيداز خلال مرحلة البلوغ يشير أثار هذا التدخل زاد تدهور البروتين عصاري خلوي 19. الخطوة الرئيسية في تقييم النشاط β غالاكتوزيداز هي ضمان جفاف فعال. عدم تيبس فعال الحيوانات يؤدي إلى سوء توفير الركيزة X-غال وبالتالي ضعف اللون الأزرق في عضلات الجسم الجدار من الحيوانات. لضمان جفاف جيد يجب أن يتم التحقق الختم على المجفف ويجب فحص عينة في 5-10 دقيقة على مدار فترات جفاف لتقييم التقدم (أي عينة 20 ميكرولتر أن جفت في غضون 10 دقيقة و 20 دقيقة المتبقيةهو التأكد من جفاف شامل). فحص β غالاكتوزيداز هو بالتالي مقايسة النشاط عنصر تحكم المناسبة أمر ضروري. بالإضافة إلى ذلك، انخفضت تلطيخ البالغين في حالة العلاج قريب للسيطرة لا يثبت أن تدهور يحدث. بل يشير إلى انخفاض النشاط الأنزيمي في الاستجابة للعلاج. لتأكيد التدهور، يجب أن تكتمل مزيد من التحليل لطخة غربية كثيفة العمالة ضد β غالاكتوزيداز 13 وهذا يسمح تدهور البروتين الكمي في أعداد صغيرة من الديدان فرزها. غرب كثافة الفرقة لطخة يمكن قياسها كميا باستخدام يماغيج 46. آخر الحد من هذه الطريقة هو أن استخدام البروتينات المعدلة وراثيا لا إعلام لأهداف الفسيولوجية للتدهور وأجوبة لمثل هذه الفرضية مدفوعة البقع الغربية البروتين و / أو المستهدفة يجب أن تستخدم 13. أخيرا، وتخليق البروتين المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسات يغلق في مرحلة البلوغ في وقت مبكر 19 </suP>، يجب أن تستخدم أساليب أخرى عندما الراغبين في دراسة تغيرات في العضلات تخليق البروتين في C. تطويره بالكامل ايليجانس العضلات. على سبيل المثال، وأساليب النظائر مستقرة أو مشعة.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |