アン<em>体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための>モデル
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。
Introduction
また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子1における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD 4の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。
非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気8における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年5クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。
GLDでの役割は長い間無視されてきたが、球様細胞は、GLDの病理学の顕著な特徴である。興味深いことに、これらの細胞は、GLDのCNS組織における最も初期の特徴的な変化の一つである。知識の欠如が原因多核食細胞の形成は、他の疾患における巨細胞と呼ばれることを前提に、一般的に病理の結果ではなく、初期の病原性駆動力9とみなされている可能性があります。したがって、WHIのメカニズムを調査し、いくつかの研究がなされているchのグロボイド細胞が特にGLDのCNSにおいて、食細胞から形成される。本報告書に記載されている手順は、CNS中球様細胞の形成及びin vitroでのミクログリアのこれまでのデモサイコシン誘発性多核化の重要性に焦点を当て、これらの細胞は食作用活性の高いレベルを示した。これらの観察と一致して、トウィッチャー脳における球様細胞は、頻繁に食作用活性の高いレベルを示唆し、PAS陽性の破片が含まれています。グロボイド細胞はまた、フェリチンのために免疫陽性であることが見出されている（小膠細胞のマーカー）10、KP-1 / CD68（単球マーカー）、およびいくつかはまた、ビメンチンに対して陽性である（中間径フィラメントタンパク質およびアストロサイトのマーカーおよび活性化ミクログリア）11、 HLA-DRA（MHCII表面受容体）、およびTNF-α7、及び伊庭-1 12（小膠細胞を識別するために使用されるカルシウム結合タンパク質）。マーカーのこのコレクションをもとに、球様細胞が発達ミクログリアから発信ユニークな表現型。
彼らの独自性にもかかわらず、特定の機能とGLDの病因へのGCの寄与が大部分は見落とされています。球様細胞は、慢性脱髄の二次的な結果であると考えられてきた。しかし、GLDの白質の病理学に球様細胞の時間的関連性を検討し、過去の研究では、出生後早期の期間に、後期胚形成中球様細胞の存在を同定した。オリゴデンドロサイトのアポトーシスおよび明白な脱髄13に先行回。したがって、GLDにおいて神経病理の発症の時間的シーケンスは、グロボイド細胞がこの疾患の14脱髄の予め形成されていることを示唆している。これはGLD中球様細胞の初期形成はオリゴデンドロサイトのダメージ15に二次的に、反応性応答ではなく、定義する病原性事象を表すことが私たちの仮説につながった。さらに、GLDにおけるミクログリアの活性の調節不全は、事実上考えられてきたrは、この疾患を治療するための16 hematopeotic幹細胞治療の長期有効性を制限する。したがって、プシコシンに応答して細胞機能及びミクログリアの規制、グロボイド細胞を、調査GLDの病因に新たな洞察を提供することが期待される。
最近まで、球様細胞の形成を研究するための適切なモデルの欠如は、GLDの病理学にこれらの細胞の正確な機能と貢献の理解を制限されていた。最近の研究では、グロボイド細胞様細胞がプシコシンに直接応答して、GLDに蓄積する病原性脂質毒素を形成することができることが判明した。私たちは、ミクログリアを発見したではなく、マクロファージは、活性化され、15をサイコシンに応じて、一次グリア培養における球様細胞に形質転換する。球様細胞へのこの変換は、細胞外プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-3 15により媒介されることが見出された。さらに最近では、私たちこのin vitroモデル系で開発されたものサイコシン活性化ミクログリアと球様細胞をこれらの調査結果を拡張し、決定したオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に強力に有毒である。したがって、GLD、サイコシンやこの疾患におけるミクログリアのための新たなプライマリおよびおそらく病原性の役割を支持する脱髄の前に球様細胞の形成の初期の蓄積の文脈で考えると。
私たちは、球様細胞形成の研究は、この病気の理解に貢献するGLDの病因に関する新しい情報を明らかにすることを提案する。また、GLDこの新しい細胞モデルは、この疾患の病理学的変化に対処するための新規な治療的アプローチをテストすることができ、そこから新たなフォーマットを提供することができる。したがって、本報告書で、私たちは、非ミエリン形成グリアの初代培養からサ イコシン誘発性球様細胞のインビトロ開発のための詳細なプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための21本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
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