Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.
leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) 1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל 2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של 4 GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid 5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק.
מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו 8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם 'globoid תאים' והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו.
תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה 9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) 10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) 11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α 7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) 12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי.
למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי 13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו 14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte 15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו 16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD.
עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine 15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו.
אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות 21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
Laminin | Sigma | L2020 |
Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
Psychosine | Sigma | P9256 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
HEPES | Sigma | BP310-500 |