Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien
Summary
Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.
Abstract
Methoden zur Erkennung und Überwachung der mitochondrialen Außenmembran Protein-Komponenten in tierischen Geweben sind entscheidend für mitochondriale Physiologie und Pathophysiologie zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, bei der Mitochondrien aus Gewebe isoliert werden Nagetier immun und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Mitochondrien werden von Nagetieren Rückenmark isoliert und zu einem schnellen Anreicherungsschritt unterzogen, Myelin, eine Hauptverunreinigung der mitochondrialen Fraktionen aus Nervengewebe vorbereitet zu entfernen. Isolierten Mitochondrien werden dann mit einem Antikörper, der Auswahl und einen fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper markiert. Analyse durch Durchflusszytometrie verifiziert die relative Reinheit der mitochondrialen Präparationen durch Anfärben mit einem Farbstoff spezifische mitochondriale, gefolgt von der Detektion und Quantifizierung von immunmarkierten Proteins. Diese Technik ist schnell, quantitativ und mit hohem Durchsatz, so dass für die Analyse von Hunderten von Tausenden von Mitochondrien pro Probe. Sie ist anwendbar auf Roman S. zu bewertenroteins auf mitochondrialer Oberfläche unter normalen physiologischen Bedingungen als auch die Proteine, die während der Pathologie mislocalized dieser Organellen werden kann. Wichtig ist, dass dieses Verfahren auf Fluoreszenzindikatorfarbstoffen gekoppelt werden, um für bestimmte Aktivitäten des mitochondrialen Subpopulationen melden und machbar für Mitochondrien aus dem zentralen Nervensystem (Gehirn und Rückenmark) sowie Leber.
Introduction
Mitochondrien sind Organellen, die hochdynamische mehrere Runden von Spaltung und Kernfusion unterzogen werden, sind auf Seiten der hohen Energiebedarf transportiert und reagieren schnell auf Reize physiologischen 1. Da es zunehmend in verschiedenen Geweben erkannt, dass die Mitochondrien, auch unterschiedlichen zellulären Kompartimenten, haben unterschiedliche Funktionsprofile, neue Methoden benötigt werden, um diese verschiedenen mitochondrialen Untergruppen zu identifizieren.
Mikroskopie liefert ein Mittel, wodurch einzelne Mitochondrien sichtbar gemacht werden und die Anwesenheit eines Proteins an oder in Mitochondrien kann durch Immunfluoreszenz-2 bestimmt werden. Quantitative Analyse nach diesem Verfahren ist jedoch arbeitsintensiv und eignet sich besser für Experimente mit immortalisierten Zelllinien oder primäre. Das Studium der einzelnen Mitochondrien aus Gewebe abgeleitet ist deutlich schwieriger und die meisten Methoden nicht für eine einfache Identifizierung der mitochondrialen Untergruppen gleichzeitig mit der Evalu ermöglichenation der mitochondrialen Funktion 3.
Um diese Hürde, ein neues Verfahren zu Mitochondrien aus Nagetier Gewebe isoliert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert immunolabel Adresse entwickelt. Dies ermöglicht den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Proteinen an der äußeren Mitochondrienmembran, die einer Analyse durch Mikroskopie verglichen lokalisiert ist viel weniger arbeitsintensiv und erlaubt die Analyse von Tausenden von Mitochondrien in einer einzigen Probe. Dieser Test kann angewendet werden, um das Schicksal und die relative Menge der mitochondrialen Außenmembran-Proteine, die Gedanken zu sein konstitutiv an der Mitochondrien zu überwachen, die Rekrutierung von Proteinen an der Oberfläche der Mitochondrien oder die Detektion von Proteinen in die Mitochondrien in pathologischen Bedingungen mislocalized. Außerdem ist die Einarbeitung von herkömmlichen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen erlaubt die gleichzeitige Auswertung von bestimmten Aspekten der mitochondrialen Funktion in verschiedene mitochondrialeSubpopulationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wird immer offensichtlicher, dass die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle sowohl in der normalen Physiologie und Krankheit. Während Immunoblotting kann feststellen, welche Proteine in Mitochondrien oder an der Oberfläche der Mitochondrien in einem bestimmten Zustand zu finden sind, diese Methode berichtet über dem Durchschnitt der Gesamtbevölkerung. Diese Methode kann nicht liefern Informationen zu relativen Häufigkeiten der mitochondrialen Subpopulationen oder Teilmengen. Während es zuvor angenomm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Laurie Destroismaisons und Sarah Peyrard für hervorragende technische Unterstützung und Dr.Alexandre Prat für den Zugang zum Durchflusszytometer. Wir möchten auch Dr. Timothy Miller für seinen Beitrag anerkennen, in Bezug auf die Entfernung von Myelin von den Vorbereitungen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuskuläre Forschung Partnerschaft, kanadischen Stiftung für Innovation, ALS Society of Canada, der Frick-Stiftung für ALS-Forschung, CHUM Stiftung und Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) unterstützt. Sowohl CVV und NA sind Forschung Gelehrten des Fonds de la Recherche en Santé du Québec und New CIHR Ermittler. SP wird von der Tim Noël Studentship von der ALS-Gesellschaft von Kanada unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
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