Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën
Summary
Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.
Abstract
Methoden voor het opsporen en monitoren mitochondriale buitenste membraan eiwit componenten in dierlijke weefsels zijn van vitaal belang om mitochondriale fysiologie en pathofysiologie bestuderen. Dit protocol beschrijft een techniek waarbij mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel immunologisch en door flow cytometrie geanalyseerd. Mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren ruggenmerg en onderworpen aan een snelle verrijkingsstap om myeline, een belangrijke verontreiniging van mitochondriale fracties bereid uit zenuwweefsel verwijderen. Geïsoleerde mitochondria worden dan gelabeld met een antilichaam van keuze en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam. Analyse door flow cytometrie controleert de relatieve zuiverheid van mitochondriale preparaten door kleuring met een mitochondriale specifieke kleurstof, gevolgd door detectie en kwantificering van eiwit immunologisch. Deze techniek is snel, kwantificeerbare en high-throughput, waardoor de analyse van honderden duizenden mitochondria per monster. Het is van toepassing op nieuwe p beoordelenroteins het mitochondriale oppervlak onder normale fysiologische omstandigheden en de eiwitten die in pathologie mislocalized kunnen worden bij dit organel. Belangrijk is, kan deze methode worden gekoppeld met fluorescentie-indicator kleurstoffen verslag over bepaalde activiteiten van mitochondriale subpopulaties en haalbaar is voor mitochondriën van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) en lever.
Introduction
Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die meerdere rondes van kernsplijting en kernfusie ondergaan, worden vervoerd naar sites van hoge vraag naar energie en snel te reageren op fysiologische stimuli 1. Aangezien meer en meer erkend dat mitochondriën in verschillende weefsels, zelfs verschillende cellulaire compartimenten, hebben verschillende functionele profielen nieuwe methoden nodig om deze verschillende mitochondriale subsets identificeren.
Microscopie verschaft een middel waarmee individuele mitochondria worden gevisualiseerd en de aanwezigheid van een eiwit op of in mitochondriën kan worden bepaald door immunofluorescentie 2. Echter, kwantitatieve analyse van deze methode is arbeidsintensief en is meer geschikt voor experimenten met geïmmortaliseerde of primaire cellijnen. De studie van individuele mitochondria uit weefsel aanzienlijk moeilijker en de meeste methoden niet mogelijk voor gemakkelijke identificatie van mitochondriale subsets gelijktijdig met de evaluatie van de mitochondriale functie 3.
Om deze hindernis, een nieuwe werkwijze voor mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsels en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie immunolabel aanpakken ontwikkeld. Dit maakt de snelle detectie en kwantificering van eiwitten gelokaliseerd in de buitenste mitochondriale membraan, die aan microscopie opzichte analyse is veel minder arbeidsintensief en maakt de analyse van duizenden mitochondria in een enkel monster. Deze test kan worden toegepast op het lot en de relatieve hoeveelheid mitochondriaal buitenste membraaneiwitten die geacht constitutief aanwezig in de mitochondriën te volgen, de rekrutering van eiwitten aan het oppervlak mitochondriale of de detectie van proteïnen mislocalized naar de mitochondriën bij pathologische omstandigheden. Bovendien is de integratie van conventionele fluorescente indicator kleurstoffen maakt het gelijktijdige evaluatie van bepaalde aspecten van mitochondriale functie in verschillende mitochondrialesubpopulaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het wordt steeds duidelijker dat de mitochondriën zijn belangrijke spelers in zowel de normale fysiologie en ziekte. Terwijl immunoblotting kan bepalen welke eiwitten binnen mitochondria of het mitochondriale oppervlak in een bepaalde toestand, deze methode rapporten over het gemiddelde van de gehele populatie. Deze methode kan geen informatie over de relatieve abundanties van mitochondriale subpopulaties of subsets opleveren. Hoewel het is al eerder werd aangenomen dat alle mitochondriën zijn gemaakt gelijk, wordt he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Laurie Destroismaisons en Sarah Peyrard voor uitstekende technische ondersteuning en Dr.Alexandre Prat voor de toegang tot de flowcytometer. Wij zouden ook graag Dr Timothy Miller erkennen voor zijn bijdrage met betrekking tot de verwijdering van myeline van de voorbereidingen. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Neuromusculaire Research Partnership, de Canadese Stichting voor Innovatie, ALS Society of Canada, de Frick Stichting ALS onderzoek, CHUM Stichting en het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec (CVV). Zowel CVV en NA zijn wetenschappelijke onderzoekers van het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec en CIHR nieuwe onderzoekers. SP wordt ondersteund door de Tim Noël studententijd van de ALS Society of Canada.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
