Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Streptococcus pneumoniae, eine gemeinsame Kolonisator des polymikrobiellen Gemeinschaft des Nasenrachenraums, ist in der Lage, mit anderen Pneumokokken und eng verwandten Arten durch die Produktion von bakteriell produzierten antimikrobiellen Peptide (Bacteriocine) konkurrieren. Jeder vollständig sequenzierten Pneumokokken-Stamm bis heute untersucht enthält eine Version des b acteriocin- l ike p eptide Ort, BLP. Bacteriocin-Produktion durch Pneumokokken nachgewiesen wurde im Ergebnis der in vitro und in vivo Konkurrenz 1-4 wichtig. Wettbewerbsdynamik werden durch die Expression von verschiedenen Bakteriozine zusammen mit verwandten Proteinen Immunität in Reaktion auf eine spezifische Peptid-Pheromon beeinflusst. Induktion der BLP-Locus durch ein Quorum Sensing System, bei dem ein Peptid-Pheromon, BLPC, bindet an das Sensorkinase, BlpH gesteuert und löst eine Signalkaskade, was zu derTranskription des BLP Locus 5,6. Es gibt vier allelische Variationen BLPC dass jede Bindung an seinen zugehörigen BlpH 6. Für die Zelle, die Auswirkungen seiner eigenen Bakteriocin überleben, werden die Gene, die Proteine kodieren verwandten Immunität auf der gleichen Operon wie jede der Bakteriocin-Genen transkribiert. Tötung tritt auf, wenn ein Teilnehmer-Stamm ist nicht in der Lage, die BLP-Locus in Antwort auf exogene Pheromon hochregulieren oder, wenn der Stamm fehlt die spezifische Immunität Gen zum Schutz benötigt. Der Transporter-Komplex, BlpAB ist für die Sekretion und Prozessierung des Peptids Pheromon und Bakteriocin-Peptide 2,4 erforderlich. Kürzlich wurde gezeigt, dass ein signifikanter Anteil der Pneumokokken-Stämme "Betrüger" bedeutet, dass sie eine Mutation im konservierten blpA Gen, das sie nicht in der Lage Pheromone und Bakteriozine 1,2 sezer macht haben. Diese Stämme sind in der Lage, auf exogene BLPC 2 durch Wiehern sezerniert reagierenBohren Stämme so dass für die Herstellung von Proteinen Immunität.
Obwohl rohe Zubereitungen von Bakteriozine aus Überständen aus Produktionsstämme mit biochemischen Methoden vor, um Reinheit zu erzielen, hergestellt werden, ist dieser Ansatz nicht nützlich für das Screening von großen Sammlungen von Isolaten und wenn der Pegel des Bakteriocin Expression niedrig in Brühe gewachsenen Kulturen 2,7 9. Die Overlay-Assay ist als schnelle Möglichkeit, die Wettbewerbsdynamik zwischen den Stämmen, die in vitro zu untersuchen existieren können verwendet. Um dies zu tun, ist eine Pneumokokken-Stamm vorgeimpft auf einer Agar-Platte und erlaubt, zu wachsen, um lokale Bakterienkonzentrationen ausreichend für die Induktion des BLP Ort zu erreichen. Ein zweiter Stamm wird dann in einem geschmolzenen weichen Agar-Lösung, die dann über die vorgeimpft Stamm zur Empfindlichkeitstest wird angewendet, inokuliert. Um die Aktivität der BLP-Locus (unabhängig von der Inhibitoraktivität) zu bewerten, können Stämme mit einer Reihe von th lagert werdenree zuvor beschriebenen BLPC Reporter-Stämme. Diese Stämme wurden konstruiert, um eine von drei verschiedenen blpH Allele, die zu den drei häufigsten BLPC Pheromone vom Pneumokokken sezerniert antworten enthalten. Die Reporterstämme haben einen integrierten lacZ-Gen, das unter der Kontrolle eines BlpH abhängigen Promotor ist und tragen eine Deletion im Gen, das BLPC Selbststimulation 10,11 verhindert.
Das Overlay-Assay ist ein schneller Weg, um den Bereich der Tätigkeit für Bakteriozin Hersteller zu ermitteln und Wettbewerbs Wechselwirkungen, die unter Pneumokokken-Stämme auftreten können, zu demonstrieren. Die Overlay-Assay lässt sich an für das Screening mehrere Stämme für Bakteriozin Produktion auf einer einzigen Platte zu verwenden. Wir haben erfolgreich große Stammsammlungen mit diesem Test mit Hilfe eines 48-Pin-Replikator an SBA-Platten von einer Hälfte einer 96-Well-Platte zu impfen gescreent. Nach …
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
37 °C water bath | |||
37 °C incubator with 5% CO2 | |||
15 ml conical tube |