Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, een gemeenschappelijke kolonisator van het polymicrobiële gemeenschap van de neus-keelholte, is in staat om te concurreren met andere pneumokokken en nauw verwante soorten door de productie van bacterieel geproduceerd antimicrobiële peptiden (bacteriocins). Elke volledig gesequenced pneumokokken soort tot op heden onderzocht bevat een versie van de b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bacteriocine productie door pneumococcen is aangetoond belang bij de uitkomst van zowel in vitro als in vivo competitie 1-4 zijn. Concurrentiedynamiek worden beïnvloed door de expressie van diverse bacteriocinen samen met verwante immuniteit eiwitten in antwoord op een specifieke peptide feromoon. Inductie van de BLP locus wordt bestuurd door een quorum sensing systeem waarin een peptide feromoon BlpC, bindt aan de sensor kinase, BlpH en initieert een signalerende cascade resulteert in detranscriptie van het BLP locus 5,6. Er zijn vier allelische varianten van BlpC die elk binden aan het verwante BlpH 6. Voor de cel om de effecten van zijn eigen bacteriocine overleven, zijn de genen die immuniteit verwante eiwitten coderen getranscribeerd op hetzelfde operon als elke bacteriocine genen. Killing treedt op als een concurrent stam niet in staat is de BLP locus upregulate in reactie op exogene feromoon of, indien de spanning niet over de specifieke immuniteit gen nodig voor bescherming. De transporteur complex, BlpAB vereist voor uitscheiding en verwerking van het peptide feromoon en bacteriocine peptiden 2,4. Onlangs is aangetoond dat een aanzienlijk deel van de pneumokokken stammen zijn "bedriegers", wat betekent dat ze een geconserveerde mutatie in het blpA gen dat maakt ze niet in staat om feromonen en bacteriocins 1,2 afscheiden. Deze stammen zijn in staat om te reageren op exogene BlpC 2 afgescheiden door hinnikenboring stammen waardoor de productie van immuniteit eiwitten.
Hoewel ruwe preparaten van bacteriocinen uit supernatanten kunnen worden bereid uit productiestammen middels biochemische methoden stappen om zuiverheid te bereiken, is deze benadering niet nuttig voor het screenen van grote verzamelingen isolaten en wanneer het niveau van bacteriocine expressie laag in bouillon gekweekte kweken 2,7- 9. De overlay assay wordt gebruikt als een snelle manier om de competitieve dynamiek tussen stammen die kunnen bestaan in vitro onderzoeken. Hiervoor een pneumococcen stam vooraf geïnoculeerd op een agarplaat en mag groeien lokale bacteriële concentratie voldoende voor inductie van de BLP locus bereiken. Een tweede stam wordt vervolgens geïnoculeerd in een gesmolten zachte agar oplossing die vervolgens via pre-geïnoculeerde stam testen op gevoeligheid wordt toegepast. Om evalueren activiteit van de BLP locus (onafhankelijk van remmende activiteit) kunnen stammen worden bedekt met een reeks three eerder beschreven BlpC reporter stammen. Deze stammen werden gebouwd op een van de drie verschillende blpH allelen die inspelen op de drie meest voorkomende BlpC feromonen afgescheiden door de pneumokokken bevatten. De reporter stammen hebben een geïntegreerde lacZ gen dat onder controle van een BlpH afhankelijke promoter en dragen een deletie in het gen dat blpC zelfstimulatie 10,11 voorkomt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze overlay test is een snelle manier om het bereik van activiteit bacteriocine producenten bepalen en competitieve interacties die kunnen optreden onder pneumococcen stammen tonen. De overlay test kan worden aangepast om te gebruiken voor het screenen van meerdere stammen voor bacteriocineproductiekinetiek op een enkele plaat. We hebben met succes grote stam verzamelingen deze assay gescreend met een 48-pin replicator SBA platen enten van een helft van een 96-well plaat. Na een nacht incubatie wordt de groei naar de T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
