植物害虫の相互作用の研究のために必要とされる効率的なハダニの均質な試料の調製、実験的な植物の侵入、および植物の損傷の評価のためのプロトコルが、開発された。
ナミハダニ、 ナミハダニは 、経済的価値の150以上を有する種の著しく幅広い、上フィードユビキタス多食節足動物草食動物である。それは、特にナス科およびウリ科トウモロコシ、綿など( 例えば 、トマト、ナス、ピーマン、キュウリ、ズッキーニ)、温室効果観賞植物( 例えば 、バラ、キク、カーネーション)、毎年恒例の畑作物(内、温室作物の主要害虫である大豆、テンサイ)、および多年生の文化(アルファルファ、イチゴ、ブドウ、柑橘類、およびプラム)の1,2。それが重要な農業害虫になり、極端な過食に加えて、T.ナミハダニ 3-7 は、その制御のために使用される殺虫剤および殺ダニ剤の広い配列に耐性を発現する傾向を有する。
ナミハダニは、(27℃で7日間)迅速なライフサイクルを有するように、優れた実験的な生物であるかつ容易に実験室での高密度に維持することができる。 ( インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色を含む)の遺伝子発現をアッセイし、RNA干渉を用いたハダニ内因性遺伝子の発現を不活性化するための方法が8-10開発されている。最近では、Tの全ゲノムシーケンスナミハダニはすでにその宿主植物( シロイヌナズナやトマトナス·リコペルシカム )11の一部に存在する同等のゲノムリソースを持つモデル生物として、この害虫草食動物を開発する機会を作成し、報告されている。一緒に、これらのモデル生物は、植物害虫の相互作用の分子基盤への洞察を提供することができます。
ここでは、大規模な成人女性のダニの数、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価を迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法が記載されている。提示されたプロトコルエンその後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階(卵、幼虫、若虫、成人男性、女性)で個人の何百もの高速で効率的な収集をディセーブルさ。
植物の害虫の相互作用は非常に科学的、経済的に重要なトピックである。それは、歴史的に(例えばトマトなど)の両方作物植物とモデル工場、Aを用いて検討したシロイヌナズナ 。両方の場合において、草食動物に対する植物の感受性は、草食動物の攻撃の後にまたは間接的に害虫の性能の評価を介して直接植物表現型の評価のいずれかを介して測定することができる。
植物の感受性の直接測定は、方法の範囲を使用して害虫種の数のために、以前に使用した。例えば、鱗翅目の幼虫の食害は、グリッド12の助けを借りて、肉眼でコナガ (コナガ)またはトリコプルシア (キャベツルーパー)のいずれかで消費される植物組織の一部の推定として測定される。また、その後の定量的画像解析による葉の損傷のデジタル画像を利用する方法があります。このような方法はに使用したAの研究アザミウマ (ミカンキイロアザミウマ)13、Scaptomyzaフラバ (リーフマイニングショウジョウバエ)14、およびTとシロイヌナズナの対話NI 15。
植物の感受性の間接的な測定は、広く植物害虫の相互作用の研究に使用される。 A.の例については、感受性シロイヌナズナアブラムシモモアカアブラムシの食害を桃には、一般的に害虫の繁殖力との相互作用16,17の後の植物の全体の形態の記述の分析を通じて評価される。 Aの別の典型的な間接的な指標害虫へのシロイヌナズナの感受性は、草食動物の乾燥や湿潤重量の評価である。このパラメータは、一般に、 モンシロチョウ (小白)、Pとして、lepidoteransの草食性を特徴付けるために使用されているコナガ 、またはTその幼虫や蛹の段階15,17のNI。
ハダニは、セルの内容FEですeders。ダニによる損傷は、緑の淡い白から色の範囲退緑斑点の集合体として認識されている。ハダニの食害に植物宿主の感受性は、以前にハダニのパフォーマンス日数の分析を通じて間接的に評価した後に侵入18,19、または直接植物週間後蔓延18の全体の形態を使用したり、公開される葉のデジタル画像を使用してその後の自動画像解析19日間ダニへ。これらのメソッドを開発し、トマト植物とTとの相互作用の研究のために使用されていたナミハダニ、典型的には、混合ダニ集団から集めた後、柔らかい毛ブラシを用いて、葉の表面上に配置したハダニの数が少ない(処置あたり5-15)を使用した。しかし、これらの方法は、ダニの大きい番号が適用される必要の研究には適していない。また、画像解析ソフトにおける枚葉画像の直接処理しながらアドビフォトショップ(サンノゼ、CA)又はImageJの20トマト損傷の分析のために使用することができるよう、これらのプロトコルは、表面のより大きな反射率を有するか、または軽く(着色及び視認性の高い毛状突起を有している、葉に適用するために変更が必要例えば 、 シロイヌナズナ )植物の損傷をマーク退緑斑点の自動選択を妨害する。さらに、容易に以前の方法で利用することができハダニの発育段階が最も普及していると容易に識別成人女性に限定し、他の発達段階の利用を妨げるされています。
植物ハダニ相互作用のハイスループット分析に向けた最初の重要なステップは、ハダニを植物に挑戦し、確実な相互作用の成果を評価するために、再現性のあるシンプルで堅牢なプロトコルを確立することである。
このビデオ、大型のテンキーを迅速かつ簡単に収集するための効率的な方法では成人女性のダニのBER、実験プラントホスト上の応用、およびハダニ供給による植物被害の評価が記載されている。提示されたプロトコルは、その後の実験の用途に用いることができる任意の発達段階(卵、幼虫、若虫、成人男性、女性)で個人の何百もの高速で効率的な収集を可能にします。さらに、これらのプロトコルには、任意のダニ宿主植物に適用することができるが、特にA.例において実証されているシロイヌナズナ 。
このビデオでは、分離することと、大人の女性のダニ数の多い植物をはびこるために使用されるプロトコルを示しています。我々はAを使用して、このプロトコルを提示したがシロイヌナズナには、任意の植物ハダニインタラクションシステムのために使用することができるし、現在正常にトマト、ブドウ( ビニフェラ種 )植物にも適用されている。収集されたダニが同?…
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Plant material: | |||
California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
Chemicals: | |||
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
Other materials and equipment: | |||
Plastic tray | Any supplier | NA | – |
Set of scissors | Any supplier | NA | – |
2 L beakers | Any supplier | NA | – |
Paper towels | Any supplier | NA | – |
Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
Thin brush | Any supplier | NA | – |
Pipettes | Any supplier | NA | – |
Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
Stereoscope | Any supplier | NA | – |
Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |