Protocollen voor een efficiënte bereiding van homogene monsters van spintmijten, aantasting van experimentele installaties, en beoordeling van plantaardige schade, zoals vereist voor studies van planten-plaaginteractie werden ontwikkeld.
De twee-spotted spint, Tetranychus urticae, is een alomtegenwoordige polyfage geleedpotige herbivoor die zich voedt met een opmerkelijk breed scala aan soorten, met meer dan 150 van de economische waarde. Het is een belangrijke plaag kas gewassen, vooral Solanaceae en Cucurbitaceae (bijvoorbeeld tomaten, aubergines, peper, komkommer, courgette) en kas sierplanten (bijvoorbeeld rozen, chrysanten, anjers), jaarlijkse veldgewassen (zoals maïs, katoen, sojabonen en suikerbieten), en in eeuwige culturen (alfalfa, aardbeien, druiven, citrusvruchten, en pruimen) 1,2. Naast de extreme polyphagy dat het een belangrijke landbouwongedierteinsect, T. maakt urticae heeft de neiging om resistent te worden tegen een breed scala van insecticiden en acariciden die worden gebruikt voor de controle 3-7.
T. urticae is een uitstekend experimenteel organisme, aangezien het een snelle levenscyclus (7 dagen bij 27 ° C)en kan gemakkelijk worden gehandhaafd op een hoge dichtheid in het laboratorium. Methoden om genexpressie (met inbegrip van in situ hybridisatie en antilichaamkleuring) assay en expressie van spint endogene genen met behulp van RNA-interferentie te inactiveren zijn ontwikkeld 8-10. Onlangs heeft de gehele genoomsequentie van T. urticae is gemeld, het creëren van een mogelijkheid om deze plaag herbivoor ontwikkelen als modelorganisme met gelijkwaardige genomische hulpbronnen die al bestaan in sommige van haar waardplanten (Arabidopsis thaliana en de tomaat Solanum lycopersicum) 11. Samen zouden deze modelorganismen inzichten in moleculaire grondslagen van planten-plaag-interacties te bieden.
Hier, een efficiënte methode voor snelle en eenvoudige verzameling van een groot aantal volwassen vrouwelijke mijten, de toepassing ervan op een experimentele waardplant, en de beoordeling van de plant schade door spint voeding worden beschreven. De gepresenteerde protocol enables snelle en efficiënte inning van honderden mensen op elk ontwikkelingsstadium (eitjes, larven, nimfen, volwassen mannetjes en vrouwtjes) die kunnen worden gebruikt voor de volgende experimentele toepassing.
Plant-plaaginteractie is een onderwerp van groot wetenschappelijk en economisch belang. Het werd historisch bestudeerd met behulp van zowel gewassen (zoals tomaat) en het model plant, A. thaliana. In beide gevallen kan de gevoeligheid van de installaties aan herbivoor ofwel rechtstreeks worden gemeten door middel van beoordeling van plantenfenotype na herbivoor aanval of indirect via de beoordeling van de plaag prestaties.
Directe metingen van plantaardige gevoeligheid werden eerder gebruikt voor een aantal schadelijke insect species met behulp van diverse methoden. Zo wordt herbivorie lepidopterale larven gemeten als een schatting van het gedeelte van plantenweefsel verbruikt door hetzij Plutella xylostella (diamondback moth) of Trichoplusia ni (koolspanrups) met het blote oog met behulp van een rooster 12. Ook zijn er methoden die digitale beeldvorming van bladschade met daaropvolgend kwantitatieve beeldanalyse te gebruiken. Dergelijke werkwijzen zijn gebruiktstudies van A. thaliana interactie met Frankliniella occidentalis (Californische trips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining fruitvliegje) 14, en T. ni 15.
Indirecte metingen van planten gevoeligheid worden veel gebruikt in studies van planten-plaaginteractie. Bijvoorbeeld, de gevoeligheid van A. thaliana te perzikluis Myzus persicae herbivory wordt meestal bepaald door analyse van ongedierte vruchtbaarheid en beschrijving van het bruto morfologie van een plant na interactie 16,17. Een ander typisch indirecte indicator van A. thaliana gevoeligheid voor een plaag is een droog of nat gewicht beoordeling van de herbivoor. Deze parameter wordt vaak gebruikt om herbivorie van lepidoterans, zoals Pieris rapae (kleine witte), P. karakteriseren xylostella of T. ni op hun larvale stadia of popstadium 15,17.
Spintmijten zijn cel-inhoud feEders. -Mijt veroorzaakte schade wordt erkend als een verzameling van chlorotische plekken die variëren in kleur van wit tot lichtgroen. De gevoeligheid van een waardplant voor spint herbivorie was eerder hetzij indirect via de analyse van de spintmijt prestaties dagen geëvalueerd na besmetting 18,19, of rechtstreeks met grove morfologie van planten weken na de besmetting 18 of met een digitale beeldvorming van bladeren blootgesteld mijten dagenlang met daaropvolgend automatische beeldanalyse 19. Deze methoden werden ontwikkeld en gebruikt voor onderzoek naar interacties tussen tomatenplanten en T. urticae, en meestal gebruikt kleine aantallen spintmijten (5-15 per behandeling) die werden verzameld uit de gemengde populatie roofmijten en werden op het bladoppervlak geplaatst met behulp van een zachte borstel. Echter, deze methoden zijn niet geschikt voor studies waarbij grotere aantallen mijten moeten worden toegepast. Bovendien, terwijl de directe verwerking van bladbeelden beeldanalyse softwarezoals Adobe Photoshop (San Jose, CA) of ImageJ 20 kan worden gebruikt voor de analyse van tomaat schade deze protocollen nodig gewijzigd om te worden toegepast op bladeren die grotere reflectiviteit oppervlakte hebben of licht gekleurd en hebben goed zichtbaar trichomen ( bv, A. thaliana) die interfereren met geautomatiseerde selectie van chlorotische plekken die plant schade te markeren. Bovendien wordt het ontwikkelingsstadium van spintmijten die gemakkelijk kan worden gebruikt met de voorgaande methoden beperkt tot de meest voorkomende en herkenbaar volwassen vrouwen en sluit het gebruik van andere ontwikkelingsstadia.
De eerste belangrijke stap in de richting van high-throughput analyse van planten-spint interactie is reproduceerbare, eenvoudige en robuuste protocollen vast te planten uitdaging met spint en betrouwbaar interactie resultaten te beoordelen.
In deze video, een efficiënte methode voor snelle en eenvoudige collectie van een grote number van volwassen vrouwelijke mijten, de toepassing ervan op een experimentele waardplant, en de beoordeling van de plant schade door spint voeding worden beschreven. De gepresenteerde protocol zorgt voor een snelle en efficiënte inning van honderden mensen op elk ontwikkelingsstadium (eitjes, larven, nimfen, volwassen mannetjes en vrouwtjes) die kunnen worden gebruikt voor de volgende experimentele toepassing. Bovendien kunnen deze protocollen worden toegepast op elke mijt gastheerplant, maar worden in het geval van A. aangetoond thaliana.
Deze video toont protocollen gebruikt voor het isoleren en planten besmetten met grote aantallen volwassen vrouwelijke mijten. Hoewel we presenteerde dit protocol met behulp van A. thaliana, kan het worden gebruikt voor alle planten-spint interactie systeem en wordt momenteel met succes ook toegepast op tomaten en wijnstok (Vitis vinifera) planten. Het protocol levert reproduceerbare resultaten te geven dat verzamelde mijten van vergelijkbare fysiologische toestand (figuur 3).
<p c…The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the Government of Canada through Genome Canada and the Ontario Genomics Institute (OGI-046), and Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (to M.G. and V.G.). T.V.L. is a postdoctoral fellow of the Fund for Scientific Research Flanders (FWO).
Plant material: | |||
California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | NA | Two week old, well infested with spider mites two or three days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. |
Chemicals: | |||
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
Tap water | Any supplier | NA | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and peformance |
Other materials and equipment: | |||
Plastic tray | Any supplier | NA | – |
Set of scissors | Any supplier | NA | – |
2 L beakers | Any supplier | NA | – |
Paper towels | Any supplier | NA | – |
Sets of sieves | Manufactured in house | NA | Detailed instructions are available |
Thin brush | Any supplier | NA | – |
Pipettes | Any supplier | NA | – |
Pipette tips | Any supplier | NA | 0.2 and 1 mL |
1.5 mL centrifuge tubes | Any supplier | NA | – |
Air pump | Any supplier | NA | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi |
Stereoscope | Any supplier | NA | – |
Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
Computer | Any supplier | NA | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. |
Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |