Summary

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。

Abstract

肺は、宿主細胞は日常的に微生物および微生物産物に曝露されるインターフェースである。肺胞マクロファージは、吸入真菌および他の微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージおよび他の免疫細胞が病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し、下流の炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、活性酸素中間体(ROIを)を生成し、宿主防御のために重要である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。本研究の目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。ここでは、マウスαの能力を評価するための方法を記載貪食アスペルギルス胞子 (分生子)の成長を制御するためlveolarマクロファージ(AM)。肺胞マクロファージは、 インビボで染色し、10日後に気管支肺胞洗浄(BAL)マウスから単離される。マクロファージは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するA.を播種し、次いで、カバーガラス上に播種するフミ胞子 。特定の時間に、細胞を固定し、貪食された胞子を有する無傷マクロファージの数を、共焦点顕微鏡法によって評価される。

Introduction

肺胞マクロファージは、吸入微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージは、病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し摂取および吸入胞子(分生子)の成長を制限し、炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、スーパーオキシドアニオンおよび下流の活性酸素中間体(ROIを)への分子状酸素に変換します。慢性肉芽腫症(CGD)は、重度の細菌および真菌感染により、過度の炎症反応によって特徴づけられるNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患である。

NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。以前の研究では好中球が主に菌糸のステージ5をターゲットに対し、肺胞マクロファージは、 アスペルギルス胞子を摂取し、殺すことが示されている。しかし、矛盾するresulがあったA.の成長を制御するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの役割としてのts フミ胞子 6、7。

このメソッドの目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ胞子 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。最も密接に吸入菌類に対する宿主応答をモデル化するために、我々はすぐに犠牲を次の刺激されていないマウスから気管支肺胞洗浄により収穫肺胞マクロファージを使用していました。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞( 例えば 、好中球を募集)が存在しない場合に、その抗真菌活性に焦点を当てることができました。この方法では、肺胞マクロファージは、収穫後の操作の量を最小にするように収穫する前にインビボで染色した。</ pの>

この議定書のもう一つの利点は、GFPを発現するAの使用でフミ株 。この菌は菌糸のステージを通じて生子段階からのGFPを発現し、さらに染色の必要がありません。さらに詳細な画像を得るために、我々は得られた画像から3次元構造の再構築を可能にし、共焦点顕微鏡を選びました。三次元再構成は、菌糸がマクロファージやを通じて周囲に成長しているのではなく、区別できるようになります。分生子はまた、細胞外に対する細胞内のように正確に区別することができる。

Protocol

本研究では、動物で実行されたすべての手順は、ロズウェルパークがん研究所で動物実験委員会によって承認され、すべての状態を遵守し、連邦政府及び保健規則の国立研究所れた。 1。 インビボマクロファージのラベリング注:PHK26(iv)は、静脈内投与された場合、循環中および組織中の両方食細胞によって取り込まれる親油性染料である?…

Representative Results

刺激されていないマウスからBALによる肺胞マクロファージの収集は、細胞診に基づいて> 95%純粋な集団になります。 3と7時( 図2)の時点では、真菌増殖の菌糸段階に先行し、遺伝子型間生子の貪食効率の比較を可能にします。遺伝子型は、組織浸潤性菌糸のステージ( 図3)に貪食された分生子の転移を阻害する能力に関して比較することができる場合に14?…

Discussion

一緒にin vivoで真菌のチャレンジでマクロファージの抗真菌活性のex vivo分析のためにこのアプローチを使用して、我々は以前に、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼはA.に対する防御において重要な役割を果たしていることが実証されフミ4。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞( 例?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ロズウェルパークがん研究所に研究所アレルギー感染症のグラントR01AI079253(BHS)は、国立がん研究所がんセンターによる支援助成CA016056によってサポートされていました。

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4CL Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter BD  381523 Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD  297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers BD Falcon 64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell Culture Incubator 37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6 well Cell Culture Plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

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Cite This Article
Grimm, M. J., D’Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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