Summary

Évaluation de l'activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Abstract

Le poumon est une interface où les cellules hôtes sont fréquemment exposés à des microbes et des produits microbiens. Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des champignons et d'autres microbes inhalés. Macrophages et d'autres cellules immunitaires reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance et d'initier des réactions inflammatoires en aval. L'oxydase phagocyte NADPH génère des intermédiaires réactifs de l'oxygène (ROI) et est essentiel pour la défense de l'hôte. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l'hôte médiée par les neutrophiles 1 – 3, l'importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n'est pas bien définie. Le but de cette étude était de définir le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l'hôte contre A. fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer la capacité des souris unmacrophages lveolar (AMS) pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytés (conidies). Les macrophages alvéolaires sont colorées in vivo et dix jours plus tard isolées à partir de souris par lavage broncho-alvéolaire (BAL). Les macrophages sont étalées sur des lamelles de verre, puis ensemencées avec la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant A. spores fumigatus. À des moments précis, les cellules sont fixées et le nombre de macrophages avec des spores intactes phagocytées est évaluée par microscopie confocale.

Introduction

Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des microbes inhalés. Macrophages reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance, ingèrent et limitent la croissance des spores inhalées (conidies), et d'initier des réactions inflammatoires. La NADPH oxydase phagocytaire convertit l'oxygène moléculaire en anion superoxyde et des intermédiaires réactifs de l'oxygène en aval (ROI). Granulomatose chronique (CGD) est un trouble héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections bactériennes et fongiques graves et par des réactions inflammatoires excessives.

Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l'hôte médiée par les neutrophiles 1 – 3, l'importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n'est pas bien définie. Des études antérieures ont montré que les macrophages alvéolaires ingèrent et tuent les spores d'Aspergillus, alors que les neutrophiles principalement cibler le stade des hyphes 5. Cependant, il ya eu des résul contradictoirests sur le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages dans le contrôle de la croissance de A. fumigatus spores 6, 7.

Le but de cette méthode était de délimiter le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l'hôte contre A. spores fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Pour modéliser le plus à la réponse de l'hôte aux champignons inhalés, nous avons utilisé les macrophages alvéolaires récoltés par lavage broncho-alvéolaire des souris non stimulées immédiatement après le sacrifice. L'utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous a permis de mettre l'accent sur ​​leur activité antifongique en l'absence d'autres cellules du système immunitaire (par exemple, des neutrophiles recrutés) qui défendent contre Aspergillus in vivo. Dans ce procédé, les macrophages alvéolaires ont été colorées in vivo avant la récolte de manière à minimiser la quantité de manipulation post-récolte. </ P>

Un autre avantage de ce protocole est l'utilisation d'un A. exprimant la GFP souche fumigatus. Ce champignon exprime la GFP de la scène conidies par le stade des hyphes et n'a pas besoin de plus d'une coloration. Pour obtenir des images avec plus de détails, nous avons choisi la microscopie confocale, qui permet la reconstruction de structures en trois dimensions à partir des images obtenues. Reconstruction tridimensionnelle donne la possibilité de différencier les hyphes croissante autour plutôt que dans ou à travers un macrophage. Conidies peut aussi être précisément distingués comme intracellulaire contre extracellulaire.

Protocol

Toutes les procédures effectuées sur les animaux dans cette étude ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité à Roswell Park Cancer Institute et respectées tout état, fédéral, et les Instituts nationaux de la réglementation de la santé. 1. In vivo des macrophages étiquetage Remarque: PHK26 est un colorant lipophile qui sera absorbé par les cellules phagocytaires à la fois dans la circulation et dans les tissus lor…

Representative Results

Collecte des macrophages alvéolaires par BAL de souris non stimulés se traduira par une population pure à> 95% sur la base de la cytologie. Le 3 et 7 h (Figure 2) points de temps précèdent le stade des hyphes de la croissance fongique et permettent une comparaison de l'efficacité de phagocytose des conidies chez les génotypes. Le point de temps de 14 h est l'endroit où les génotypes peuvent être comparées en ce qui concerne l'aptitude à inhiber la transition de conidies …

Discussion

En utilisant cette approche ex vivo pour l'analyse de l'activité antifongique des macrophages avec challenge in vivo fongique, nous avons précédemment montré que la NADPH oxydase dans les macrophages jouent un rôle important dans la défense contre A. fumigatus 4. L'utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous permet de mettre l'accent sur ​​leur activité antifongique en l'absence d'autres cellules du système immunitaire (par exemple,</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses Grant R01AI079253 (BHS), et par l'Institut national du cancer Cancer Center Support Grant CA016056 à Roswell Park Cancer Institute.

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4CL Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter BD  381523 Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD  297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers BD Falcon 64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell Culture Incubator 37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6 well Cell Culture Plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

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Cite This Article
Grimm, M. J., D’Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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