Summary

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

Published: May 28, 2014
doi:

Summary

Применение матрицы-лазерной десорбцией / время ионизации полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS) непосредственно к культуре крови бульона ускоряет идентификацию бактерий. Представленный метод является быстрым и надежным методом идентификации грамотрицательных бактерий непосредственно из культуры крови бульоне.

Abstract

Важную роль в клинической лаборатории микробиологии является обеспечение быстрой идентификации бактерий, вызывающих инфекции кровотока. Традиционный идентификация требует суб-культуру сигнальное культуры крови бульоне с идентификации доступных только после колоний на твердой агар созрели. MALDI-TOF MS является надежным, быстрый способ идентификации большинства клинически значимых бактерий при нанесении на колоний на твердых средах. Применение MALDI-TOF MS непосредственно к культуре крови бульона является привлекательным подход, поскольку он имеет потенциал для ускорения идентификации видов бактерий и улучшить клиническое управление. Тем не менее, важной проблемой для преодоления является удаление предварительно анализ интерферирующих смол, белков и гемоглобина, содержащихся в культуре образцов крови, которые, если их не удалить, мешают MS спектров и может привести к недостаточному или низкими оценками идентификации дискриминации. Кроме того, необходимо сосредоточиться BacterИ.А. развивать спектры достаточно высокого качества. Представленный метод описывает концентрацию, очищение, и извлечение грамотрицательных бактерий, позволяющих раннего выявления бактерий из сигнальном культуры крови бульоне.

Introduction

Пациенты с инфекции кровотока (BSI) из-за бактерий по-прежнему имеют высокую смертность в стационаре, начиная от 6-48% 1. Доставка соответствующего эмпирического антибиотика способствует выживанию и в подгруппе пациентов с тяжелым сепсисом, каждый час задержки в соответствующей терапии коррелирует со снижением выживаемости 2,3. Соответственно, одной из ключевых задач клинической лаборатории является быстрое обнаружения, идентификации и общайтесь присутствие бактерий в культурах крови сообщить клинические решения. Было показано, что микробиологическая лаборатория имеет наибольшее влияние на антимикробной терапии на момент отчетности Граму 4 и недавно, обсервационное исследование показало, что время матрица-активированная лазерная десорбция / ионизация массового полета спектрометрии (MALDI-TOF MS) выполняется непосредственно на культуры крови бульонов влиять назначения в более чем одной трети BSI, вызванного грамотрицательных бактерий 5.

<p class="Jove_content"> Промышленное освоение MALDI-TOF MS привело к действенным лабораторного инструмента для идентификации микроорганизмов 6,7. Технология в настоящее время хорошо известны и была интегрирована в многих лабораториях для быстрого и точного определения микроорганизмов, выделенных на твердой среде 6,8. Прямое применение MALDI-TOF MS культуры крови (до н.э.) бульона, что дали понять, "позитивный" для микроорганизмов обращений в обоих клиницистов и лабораторного менеджеров из-за возможности получения более раннюю идентификацию микроорганизмов при низких затратах.

Клиническая полезность прямого применения MALDI-TOF MS к культуре крови бульона было ограничено широким диапазоном чувствительности наблюдаемых по сравнению со стандартным фенотипическая культуры на основе методов идентификации, с сообщениями о успешной идентификации грамотрицательных бактерий, начиная от 47-98.9 % 9-11. Изменение чувствительности всегоотносится к композиции бульона BC, начальной концентрации бактерий, вариации методов подготовки образцов, а также массив грамотрицательных организмов, встречающихся в популяции исследования 9. По сравнению с этими другими опубликованными протоколами метод, представленный здесь избегает использования этанола, хлорид аммония или дополнительного (не матрица) ацетонитрила. В результате бактериальный осадок не будет остаются жизнеспособными (до точки экстракции белка), позволяющий потенциальные методы испытаний фенотипический восприимчивость к быть нанесен непосредственно на этих организмов в бульоне. Кроме того, данный способ, как было показано, чтобы быть недорогой, надежный и быстрый с бактериальной идентификации доступных в пределах 25 мин из культуры крови грамотрицательных результатов окраски, с минимальными "руки на" время 12.

Этот метод представляет собой простой протокол в доме спин-лизис использования добычу муравьиной кислоты наносится непосредственно на положительных культуральных бульонах крови для выявления грамотрицательных бacteria с технологией MALDI-TOF MS.

Protocol

1. Кровь Культура Отвары Отметить как «Позитивный» Снимите сигнализируется бутылку культуры кровь из непрерывного мониторинга инкубационного шкафа и поместить его в кабинете биологической безопасности. Примечание: Бутылки могут содержать опасные микроорганизмы и универса?…

Representative Results

Сгенерированный MALDI-TOF MS спектры по сравнению с интегрированной справочной базы данных спектров. Логарифмическая оценка присваивается за доверие матча между тестовой изолята и справочную базу данных изолирует, с рекомендацией счетом ≥ 1,7, необходимых для возможного выявления до уров?…

Discussion

Важно при применении MALDI-TOF MS в культуральной жидкости крови, что шаги сообщение центрифугирования выполняются с достаточной осторожностью, чтобы не ремикс разделенных компонентов. Особенно важно, чтобы удалить культуры крови составляющие и клеточных белков человека, включая гемогло?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

BACTEC Plus Aerobic/F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442265
BACTEC Peds Plus Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442194
Vacutainer – Blood transfer device Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 364880 Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 367954 Serum separating tube
Syringe 10 mL Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 302143
Transfer pipette Samco, USA 222-20S
Transfer pipette (fine tipped) Samco, USA 232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany 0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free) Life Technologies, Carlsbad, California, USA 10977-015
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA F0507
Matrix solution  Bruker Daltonics, Bremen Germany 285074 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS Bruker Daltonics, Bremen Germany Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software

References

  1. Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
  2. Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
  5. Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
  6. Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
  7. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  8. Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
  9. Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
  10. March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
  11. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
  12. Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
  13. Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
  14. Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
  15. Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
  16. Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
  17. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
  18. Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
  19. Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).

Play Video

Cite This Article
Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Mitchell, D. H., Iredell, J. R., Chen, S. C. A. Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (87), e51663, doi:10.3791/51663 (2014).

View Video