Summary

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Published: May 28, 2014
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Summary

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Abstract

Eine wichtige Rolle der klinischen Mikrobiologie-Labor ist eine schnelle Identifizierung von Bakterien, die Infektion der Blutbahn liefern. Traditionelle Identifizierung erfordert die Subkultur der signalisiert Blutkulturbrühe mit Identifikations erst verfügbar, nachdem Kolonien auf festen Agar sind gereift. MALDI-TOF-MS ist ein zuverlässiges, schnelles Verfahren zur Identifizierung der meisten klinisch relevanten Bakterien als Kolonien auf festem Medium aufgebracht. Die Anwendung der MALDI-TOF-MS direkt an Blutkulturbrühe ist ein attraktiver Ansatz, da sie das Potenzial hat, Artbestimmung von Bakterien beschleunigen und zu verbessern klinische Management. Allerdings ist ein wichtiges Problem zu überwinden, die Pre-Analyse Entfernung von störenden Harze, Proteine ​​und Hämoglobin in Blutkulturproben, die, wenn nicht entfernt werden, stören die MS-Spektren und kann zu einer unzureichenden oder niedrigen Diskriminierung Identifizierung Partituren Ergebnis enthalten. Zusätzlich ist es notwendig, bacter konzentrierenia zu entwickeln Spektren von ausreichender Qualität. Die vorgestellte Methode beschreibt die Konzentration, Reinigung und Gewinnung von Gram-negativen Bakterien so dass für die frühzeitige Identifizierung von Bakterien aus einer Blutkultur signalisiert Brühe.

Introduction

Patienten mit Infektion der Blutbahn (BSI) durch Bakterien weiterhin hohe Mortalität im Krankenhaus haben, angefangen von 6 bis 48% ein. Die Lieferung der entsprechenden Antibiotika fördert das Überleben und in der Untergruppe der Patienten mit schwerer Sepsis, jede Stunde Verzögerung, um eine geeignete Therapie korreliert mit verringerten Überlebens 2,3. Dementsprechend ist ein zentrales Ziel der klinischen Labor, um schnell zu erkennen, zu identifizieren und kommunizieren die Anwesenheit von Bakterien in Blutkulturen, klinische Entscheidungen. Es hat sich gezeigt, dass die mikrobiologischen Labor hat den größten Einfluss auf eine antimikrobielle Therapie bei der Berichterstattung über die Gram-Färbung 4 und vor kurzem eine Beobachtungsstudie gezeigt, dass Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) direkt auf die Blutkulturbrühen durchgeführt beeinflussen Verschreibung in über einem Drittel der BSI, die durch Gram-negative Bakterien verursacht werden 5.

<p class="Jove_content"> Die kommerzielle Entwicklung von MALDI-TOF MS wurde auf einem Laborwerkzeug wirksam für die Identifizierung von Mikroorganismen 6,7 führte. Die Technologie ist mittlerweile etabliert und hat sich in vielen Labors für die schnelle und genaue Identifizierung von Mikroorganismen isoliert auf festen Medien 6,8 integriert. Die direkte Anwendung der MALDI-TOF-MS zu Blutkultur (BC) Brühe, die für Mikroorganismen appelliert an beide Kliniker und Laborleiter, weil das Potenzial, eine frühere Identifizierung von Mikroorganismen bei niedrigen Kosten zu erhalten "positiv" signalisiert haben.

Der klinische Nutzen der direkten Anwendung der MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe wurde von der breiten Palette der beobachteten Empfindlichkeiten beschränkt worden, als mit Standard-phänotypischen Kultur Methoden der Identifizierung, mit Berichten über erfolgreiche Identifizierung von Gram-negativen Bakterien bis hin verglichen 47-98,9 9-11%. Die Variation in der Empfindlichkeit wahrscheinlichbezieht sich auf die Zusammensetzung BC Brühe, Anfangsbakterienkonzentration, Variation in der Probenvorbereitung Methoden sowie die Anordnung von Gram-negativen Organismen in Studienpopulationen 9 gestoßen. Verglichen mit diesen anderen veröffentlichten Protokollen der hier vorgestellten Verfahren vermeidet die Verwendung von Ethanol, Ammoniumchlorid oder zusätzliche (nicht-Matrix) Acetonitril. Als Ergebnis wird das Bakterienpellet lebensfähig bleiben (bis zum Punkt des Proteinextraktion) unter Berücksichtigung der potentiellen phänotypischen Suszeptibilität Testverfahren unmittelbar auf diese Organismen in der Brühe verwendet werden. Darüber hinaus hat das vorgestellte Verfahren wurde gezeigt, kostengünstige, zuverlässige und rasche Identifizierung von Bakterien mit innerhalb von 25 min der Blutkultur Gramfärbung Ergebnisse mit minimalen "hands on" Zeit 12 ist.

Diese Methode ist eine einfache Inhouse-Spin-Lyse-Protokoll unter Verwendung von Ameisensäure Extraktion Gram-negative b identifizieren direkt an positiven Blutkulturbrühen angewendetacteria mit MALDI-TOF-MS-Technologie.

Protocol

1. Blutkultur Brühen Flagge als "Positiv" Entfernen Sie die signalisiert Blutkulturflasche von der kontinuierlichen Überwachung Brutschrank und legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank. Hinweis: Die Flaschen können gefährliche Mikroorganismen enthalten und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden müssen. Wegen der Gefahr von Infektions Aerosole bei der Probenahme, müssen alle Stichprobenverfahren in einem Biosafety Klasse II Sterilbank durchgeführt werden. <…

Representative Results

Die erzeugte MALDI-TOF MS-Spektren sind mit der integrierten Referenzspektren der Datenbank verglichen. Eine logarithmische Score ist für das Vertrauen der Partie zwischen dem Test-Isolat und der Referenzdatenbank isoliert, mit der Empfehlung von einem Score ≥ 1,7 für wahrscheinlich, Identifikation zu Gattungen Ebene (Abbildung 1) und ≥ 2,0 für wahrscheinliche Identifizierung von Arten (Abbildung erforderlich zugeordnet 2). Bericht zur Art, wenn die Punktzahl ≥…

Discussion

Es ist wichtig, bei der Anwendung von MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe, die die Post Zentrifugationsschritte werden mit ausreichender Sorgfalt durchgeführt, nicht die getrennten Komponenten remixen. Es ist besonders wichtig, die Blutkulturbestandteilen und humanen zellulären Proteine, einschließlich Hämoglobin, das Spikes Störung der MALDI-TOF-Spektren erzeugen können, zu entfernen.

Obwohl MS Hersteller empfehlen der Partitur von ≥ 2,0 für Arten geschnitten und ≥ 1,7 für Gat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

BACTEC Plus Aerobic/F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442265
BACTEC Peds Plus Medium Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 442194
Vacutainer – Blood transfer device Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 364880 Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 367954 Serum separating tube
Syringe 10 mL Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA 302143
Transfer pipette Samco, USA 222-20S
Transfer pipette (fine tipped) Samco, USA 232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany 0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free) Life Technologies, Carlsbad, California, USA 10977-015
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA F0507
Matrix solution  Bruker Daltonics, Bremen Germany 285074 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS Bruker Daltonics, Bremen Germany Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software

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Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Mitchell, D. H., Iredell, J. R., Chen, S. C. A. Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (87), e51663, doi:10.3791/51663 (2014).

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