T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em> In vivo</em
Summary
In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak> 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.
Abstract
In vivo T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi ve immünoterapilerin tasarımı için önemlidir. Ve kırmızı lazer heyecanlı boyalar (Hücre Çoğalma Boya eFluor 670: İşte biz böyle carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE), mor lazer heyecanlı boyalar (CTV CellTrace Violet): hayati boyalar kullanır floresan hedef array (FTA) teknolojinin kullanımını tanımlamak CPD )> 250 belirgin bir floresan hücre kümeleri haline etiketli fare lenfositlerinin kombinasyon yöntemiyle için. Bu STA içinde hücre kümeleri ana doku uyumu (MHC) sınıf-I ve MHC smıf-II bağlama peptidleri ile doldurulan ve bu şekilde sırasıyla CD8 + ve CD4 + T hücreleri için, hedef hücre olarak hareket edilebilir. Bu hücreler, FTA uygulanabilir ve tamamen işlevsel kalır ve bu nedenle, FTA hedef hücreler ve CD4 + T hücresi tasarlandığını yardımseverli CD8 + T hücre aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için farelere verilebilirlerakış sitometrisi ile in vivo gerçek zamanlı olarak FTA B hücresi, hedef hücrelerin, s. > 250 hedef hücreler aynı anda değerlendirilebilir bu yana, çeşitli teknik konsantrasyonlarda ve birden fazla kez tekrarlanmış çeşitli epitoplara karşı antijen T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, bu teknik, bir sayısal (yanıtın örneğin kümülatif büyüklük) ve niteliksel (örneğin,. Fonksiyonel aviditesi ve yanıtı epitop çapraz reaktivite) seviyesinde hem de T hücresi tepkilerini ölçebilir. Burada, bu FTA inşa edilmiş ve bir rekombinant çiçek virüsü aşısı ile uyarılan T hücresi tepkilerini değerlendirmek için uygulanabilir bir örnek vermek vardır açıklanmıştır.
Introduction
T hücreleri, adaptif bağışıklık yanıtında merkezi bir rol oynar ve genellikle immünoterapide manipülasyon için hedeflenir. CD4 + efektör T hücreleri, bağışıklık birçok yönlerini düzenleyen ve aynı zamanda doğrudan antikor üretimi için B hücrelerinin yardımcı olabilir sitokin salgılayarak yabancı antijene yanıt. CD8 + sitotoksik T hücreleri (CTL 'ler) aynı zamanda sitokin salgılayarak hem de doğrudan yabancı bir antijeni eksprese eden hücreleri öldüren bir rol oynayarak, yabancı antijene yanıt verebilir. Bu T hücre efektör işlevi başlatır temel etkileşim hücre yüzeyi üzerinde MHC molekülleri üzerinde görüntülenen yabancı peptidler ile T hücre reseptörü (TCR) etkileşimini içerir. CD4 + T hücreleri, tipik olarak bir mikrop bulaşmış hücreler üzerinde gösterildi MHC sınıf I molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin kabul antijen sunan hücreler ve CD8 + T hücreleri üzerinde MHC sınıf II molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin tanır.
SıraylaT hücreleri, bir immün tepkisi oynadıkları rolünü değerlendirmek için, onların efektör fonksiyonları, güvenilir ve hassas tekniklerle ölçülür esastır. T hücresi yanıtı değerlendirilmesi için yaygın yöntemler arasında; MHC class-I/II/peptide Tetramer tepkime; ELISPOT ve hücre içi sitokin lekelemesi ile sitokin üretimi; ve 51 Cr-salım deneyleri ile öldürme kapasitesi. Bu deneyler, ancak, tipik olarak in vitro stimülasyon ile ex vivo olarak veya T hücre fonksiyonunun içine sınırlı bir bilgi sağlar edilir. T hücresi tepkilerini ölçümü için in vitro uyarılması yoluyla oluşabilir fonksiyonel parametreler değişiklikleri önlemek için bu nedenle T hücrelerinin herhangi bir manipülasyon ile, ortaya İdeal olarak, bu in vivo, in situ onları değerlendirmek için yararlı olacaktır. En sık vivo T hücresi işlevsel tahlillerde kullanılan bazı in vivo olarak numaralandırılır MHC sınıf I-bağlama peptidleri ile darbeli hedef hücrelerin CTL aracılı öldürme, ölçme dayanmaktadırBöyle CFSE gibi hayati boyalar ile floresan etiketleme yoluyla algılama ile. Bunlar, in vivo deneylerde ne zaman bu tür hedefleri CTL aracılı öldürme izleyebilir olsa da, daha önce nitel parametreleri, izin vermek için gerekli olan, farklı konsantrasyonlarda ve peptit epitoplarının farklı sunulması, birden fazla hedefin öldürülmesini değerlendirmek için nispeten sınırlı bir kapasiteye sahip olması fonksiyonel aviditesi ve epitop varyant çapraz reaktivite değerlendirilecektir. Bu deneyler, aynı zamanda CD4 + T hücre aracılı tepkiler üzerinde herhangi bir bilgi vermemektedir.
Son zamanlarda tek bir hayvanda aynı anda> 250 hedef hücrelere karşı T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar floresan hedef diziler (STA) göre çok katlı bir analiz geliştirdik, T hücresi tepkilerini değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntem ile sınırlamaları birçok üstesinden gelmek için, 1, 2 akım sitometri. FTA sev ile etiketlenmiş lenfosit oluşmaktadırBenzersiz floresans> 250 hücre kümeleri elde edilecek sağlayan CFSE, CTV ve CPD gibi vital boyaların eral konsantrasyonları ve kombinasyonları yer alır. Bu hücreler, canlı ve bütünüyle işlevsel olarak kalmaları için, bunlar, in vivo 3 efektör T hücreleri ile etkileşimi izlenmesini sağlamak için hayvanlara enjekte edilebilir. Örneğin, FTA hücre kümeleri, hedef hücrelerin 1 antijen spesifik CTL aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için MHC sınıf-I-bağlama peptidleri ile pulse edilebilir. Buna ek olarak, FTA hücre kümeleri imkan veren, MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile doldurulan edilebilir antijene spesifik T yardımcı hücresi örneğin CD69, CD44 ve / veya aktivasyonu ile değerlendirilmesi (aktivasyonunun değerlendirilmesi ile (T H) aktivitesinin değerlendirilmesi soydaş peptid 2 taşıyan FTA içinde B hücrelerinin CD62L). 250'den fazla hedefler aynı anda tespit edilebildiğinden, bu n ile doldurulan çok sayıda hedef hücre kümeleri karşı CTL ve T H tepkilerini ölçmek mümkündürfarklı konsantrasyonlarda ve pek çok kez tekrarlanabilir ve de dahil umerous peptidler. FTA tahlil bu nedenle in vivo T hücre efektör cevabının değerlendirilmesinde görülmemiş bir düzeyi sağlar.
Burada ayrıntılı olarak FTA yapımını tarif ve in vivo olarak T hücresi tepkilerini değerlendirilmesi uygulanabilir şeklini göstermektedir. Prosedür, MHC sınıf I ve II-bağlama peptidleri ile doldurulan 42 hücre kümelerinin 6 tekrarlar oluşan üç vital boyaların kullanımı yoluyla 252 belirgin bir hücre kümeleri içeren bir FTA birlikteliğinin yapımını da açıklar. Etiketleme miktarını azaltmak için gerekli olan 42 hücre kümelerinin etiketleme tüpleri dipli, 10 ml konik ortaya çıkar ve bu da Tablo 1 'de gösterildiği gibi bir tüp rafa bu hazırlamak için yararlıdır. Bu yöntem, ayırt kümelerinin daha küçük sayıları için ayarlanabilir her bir boya 1 uygulandı.
Biz, bu tepkiler kazanmakla ölçebilir gösteren ile tahlilin programı vurgulamakFarelerin bir küçük hasta birden fazla epitoplara karşı rekombinant çiçek hastalığı virüs aşısı tarafından üretilen es. Bu, FTA deney sırasıyla yoluyla eğrisi (AUC) değerlendirmeleri ve yarı maksimal tepkileri (EC 50) oluşturmak için gerekli etkili peptid konsantrasyonunun ölçülmesi altındaki alan kullanımını kümülatif yanıtları ve fonksiyonel avidite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
FTA bazlı deneylerde avantajı, akış sitometrisi ile, tek bir konak hayvandan> 250 uygulanabilir ve tamamen işlevsel bir hedef hücre popülasyonlarının ayrımcılık sağlamasıdır. Bu, daha önce mümkün olmamıştır in vivo akış sitometri esaslı tahliller için karmaşıklık düzeyi sağlar. Bu 6 konsantrasyonlarda 7 farklı viral epitoplara yanıtlar, AUC ve EC 50 gibi parametreler in vivo T hücresi tepkileri için belirlenecek izin veren tek bir hayvanda aynı anda 6 te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Proje Destek # 1010395 (BQ ve CP) ve # 525431 (CR), ve Avustralya, Hepatit ve HIV Viroloji EOI için bir Avustralya Merkezi Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, bir Programı Hibe # 455395 (CP) tarafından desteklenen 2012 hibe (CR ve RJJ) ve Gordon ve Gretel Çoban Vakfı (BQ ve CR) bir hibe. Biz JCSMR FACS laboratuvar mükemmel bakımı için Harpreet VOHRA ve Michael Devoy teşekkür etmek isterdim, peptid sentezi için Avustralya Kanser Araştırma Vakfı Biyomoleküler Kaynak Tesisi, JCSMR, IAS, ve Dr David Boyle, CSIRO Hayvan Sağlığı Laboratuarları, Geelong, Avustralya ana HIV aşısı stokları sağlamak için.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
