Способность контролировать Т-клеточные реакции в деталях в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа. Здесь мы опишем использование люминесцентных целевых массивов (ССТ) в в естественных условиях Т-клеток анализа, который оценивает> 250 параметров одновременно с помощью проточной цитометрии.
Способность контролировать Т-клеточные реакции в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа и разработке иммунотерапии. Здесь мы опишем использование люминесцентные целевого массива технологии (FTA), которая использует жизненные красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE), фиолетовый лазерных возбудимых красителей (CellTrace Фиолетовый: CTV) и красный лазер возбудимых красителей (пролиферации клеток Краска eFluor 670: CPD ) в комбинаторно этикеток лимфоциты мыши в> 250 различимых кластеров люминесцентных клеток. Сотовые кластеры внутри этих ССТ может быть импульсным с главного комплекса гистосовместимости (МНС) связывающие пептиды класса I и МНС класса-II и тем самым выступать в качестве клеток-мишеней для CD8 + и CD4 + Т-клеток, соответственно. Эти FTA клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, и, следовательно, могут быть введены мышам с целью оценки CD8 + Т-клеточно-опосредованного убийства ССТ клеток-мишеней и CD4 + Т-клеток-медитировал Хельр FTA B клетки-мишени клеток в реальном времени в естественных условиях с помощью проточной цитометрии. С> 250 клеток-мишеней может быть оценена сразу, техника позволяет контролировать Т-клеток ответов против нескольких антигенных эпитопов в нескольких концентрациях и в нескольких повторах. Таким образом, способ может измерять Т-клеточные реакции как на количественном (например, совокупный величины ответа) и качественными (например, функциональной. Авидности и эпитоп-перекрестной реактивности в ответ) уровне. В данном случае мы описываем, как эти ССТ построены и дают пример того, как они могут быть применены для оценки Т-клеточные реакции, вызванные рекомбинантной вакцины вируса оспы.
Т-клетки играют центральную роль в адаптивного иммунного ответа и часто становятся мишенью для манипуляций в иммунотерапии. CD4 + эффекторные Т клетки реагируют на чужеродный антиген по секреции цитокинов, которые регулируют многие аспекты иммунитета, а также может напрямую помочь В-клеток для производства антител. CD8 + цитотоксические Т-клетки (CTL) также может реагировать на чужеродный антиген по секреции цитокинов, а также играет центральную роль в непосредственно убивает клетки выражая чужеродный антиген. Фундаментальное взаимодействие, которое инициирует эти функции эффекторных Т-клеток включает взаимодействие Т-клеточного рецептора (TCR) с иностранными пептидов, отображаемых на молекул МНС на поверхности клеток. CD4 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-II на антиген-представляющих клеток и CD8 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-I, которые обычно отображаются на микробных клеток, инфицированных.
В порядкеоценить роль Т-клетки играют в иммунного ответа, важно, что их эффекторные функции измеряются надежных и чувствительных методов. Общие методы оценки отклика клеток T включают в себя: МНС class-I/II/peptide тетрамером реактивность; продукция цитокинов по ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокинов; и убивая мощности на 51 Cr-релиз анализов. Эти анализы, однако, как правило, выполняются экс виво со стимуляцией в пробирке, или обеспечивают ограниченное понимание функции Т-клеток. В идеале, при измерении Т-клеточные ответы, было бы полезно, чтобы оценить их на месте, в естественных условиях, как они происходят, без манипулирования Т-клеток с тем, чтобы избежать изменений в функциональных параметров, которые могут возникнуть через стимуляцию в пробирке. Некоторые из наиболее часто используемых в естественных Т-клеток функциональных анализов, основанный на измерении CTL, опосредованного умерщвление клетки-мишени импульсных с МНС класса I-связывающих пептидов, которые перечислены в естественных условияхчерез их обнаружения через флуоресцентного мечения витальных красителей, таких как CFSE. Хотя эти типы анализов может контролировать CTL, опосредованного убийство целей, когда они происходят в живом организме, они ранее были сравнительно ограниченные возможности для оценки убийства нескольких целей, представляющих различные концентрации и различных типов пептидных эпитопов, который необходим, чтобы позволить качественные параметры, такие как функциональные алчность и Эпитоп вариант перекрестной реактивности в оценке. Эти анализы также не дает никакой информации о CD4 + Т-клеток опосредованных реакций.
Чтобы преодолеть многие из ограничений с нынешних методов, используемых для оценки Т-клеточные реакции, мы недавно разработали многозальный анализа на основе флуоресцентных целевых массивов (ССТ), которая позволяет осуществлять мониторинг Т-клеточного ответа против> 250 клеток-мишеней одновременно в одном животного проточной цитометрии 1, 2. ССТ состоят из лимфоцитов, меченных нескольконцентрации Eral и комбинации витальных красителей, как CFSE, CTV и ДСП, позволяющих> 250 клеток кластеры уникальной флуоресценции, которые будут созданы. Так как эти клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, они могут быть введены в животных, чтобы обеспечить контроль за их взаимодействие с эффекторных Т-клетках в естественных условиях 3. Например, клеточные кластеры FTA может быть импульсным с МНС класса пептидов-I-связывания, чтобы позволить оценку антиген-специфических ЦТЛ, опосредованной гибели клеток-мишеней 1. Кроме того, кластеры клеток FTA также может быть импульсным с МНС класса-II-связывающих пептидов, позволяя оценка антигена специфические Т-хелперных клеток (T H) путем оценки активности активацию (по оценке маркеров активации CD69, таких как CD44, и / или CD62L) В-клеток в пределах ЗСТ несущих родственный пептид 2. Поскольку более 250 мишени могут быть обнаружены одновременно, можно измерить ЦТЛ и Т H ответы против многих кластеров клеток-мишеней с п импульсныхumerous пептиды в различных концентрациях и включение многих повторов. FTA анализ, следовательно, обеспечивает беспрецедентный уровень Т-клеточного эффекторной оценки реакции в естественных условиях.
Здесь мы опишем подробно строительство ЗСТ и показать, как они могут быть применены к оценке Т-клеточные реакции в естественных условиях. Процедура описывает конструкцию ЗСТ, состоящей из 252 различимых кластеров клеток за счет использования трех жизненно важных красителей, состоящих из 6 повторами 42 кластеров клеток импульсных с МНС класса-I и II-связывающих пептидов. Маркировка 42 кластеров клеток происходит в 10 мл коническую дном трубки и это полезно, чтобы заложить эти в стойке трубки, как показано в таблице 1. Этот метод может быть отрегулирован для меньшим числом различаемых кластеров в соответствии с требованиями уменьшения количества маркировки каждого красителя производится 1.
Мы подчеркиваем полезность анализа, показывая, как он может измерять отвэс генерируемые рекомбинантного оспа-вирусной вакцинации против нескольких эпитопов в небольшой группе мышей. Это показывает, насколько этот анализ FTA может быть использован для измерения кумулятивные ответы и функциональный алчность через, соответственно, использование площади под кривой (AUC) оценки и измерения эффективной концентрации пептида, необходимого для генерации половиной ответов максимальные (EC 50).
Преимущество анализов РИФ-основе, что они позволяют дискриминацию> 250 населения жизнеспособным и полностью функциональный клеток-мишеней с одного животного-хозяина с помощью проточной цитометрии. Это обеспечивает уровень сложности для естественных условиях проточной цитомет?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана проекта грантов # 1010395 (BQ и СР) и # 525431 (CR), а также грантовой программы # 455395 (СР) из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, австралийский Центра гепатита и ВИЧ вирусологии ВЗ 2012 грант (CR и RJJ) и грант от Гордона и Гретель Волопаса Foundation (BQ и CR). Мы хотели бы поблагодарить Harpreet Вохра и Майкл Devoy за отличную поддержания лаборатории JCSMR FACS, Фонд Австралии онкологический научный фонд Биомолекулярная ресурсов, JCSMR, АНУ, для синтеза пептидов, и д-р Дэвид Бойл, CSIRO животных лаборатории здоровья, Джилонг, Австралия для обеспечения запасов вакцин против ВИЧ родительские.
RPMI | Sigma | R8758 | |
Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
CTV | Invitrogen | C34557 | |
CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Vortex | Scientific Industries Inc | ||
Centrifuge | Eppendorf | ||
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |