Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme örneğin hemoglobin, miyoglobin ve sitokromlar olarak Hemoproteinler olarak bilinen bir protein çok çeşitli protez grup olarak hizmet etmektedir. Bu gibi gen transkripsiyon, translasyon, hücre farklılaşması, hücre çoğalması gibi farklı moleküler ve hücresel süreçlerde rol oynamaktadır. Heme biyosentez düzeyleri, farklı dokular ve hücre türleri arasında değişiklik gösterir ve anemi, nöropati ve kanser gibi, hastalıklı koşullarda değiştirilir. Bu tekniği kullanan [4- 14C] 5-aminolevulinik asit ([14C] 5-ala), memeli hücrelerinde hema sentez seviyesini ölçmek için hema biyosentez yolunun erken öncüler biri. Bu deney, heme dahil radyoaktivite heme ve ölçüm ekstre [14C] 5-ALA ile hücrelerin inkübasyonu içerir. Bu prosedür doğru ve hızlı. Bu yöntem, heme biyosentezi göreli seviyeleri ziyade toplam heme içeriğini ölçer. Bu techn kullanımını göstermek içinhema biyosentez düzeyleri IQue birçok memeli hücre çizgileri ölçüldü.
Heme, ferros demir ve protoporfirin IX kompleks taşınması ve hemen hemen bütün canlı organizmalarda 1-3 oksijen kullanan için merkezi bir moleküldür. heme eşsiz yapısı atomlu gaz ve bir elektron taşıyıcı madde olarak işlev gibi çeşitli fonksiyonları yerine 1-5 sağlar. Örneğin, heme oksijen 6,7 transferi ve depolama için hemoglobin ve miyoglobin oksijen bağlanır. Ayrıca, solunum sırasında sitokromlar halinde bir elektron taşıyıcı madde olarak işler ve sitokrom P450 enzimleri ile katalize edilmiş 8,9-kimyasal redoks reaksiyonları için, elektron verici olarak hareket eder. Heme en önemli özelliklerinden biri de, gen transkripsiyonu, protein sentezi ve mikro-RNA biyogenez 4 gibi hücresel ve moleküler olayların düzenlenmesinde rol oynayabilir olmasıdır. Örneğin, bir memeli transkripsiyonel represör Bach1 aktivitesini ve memeli nükleer rec kontrol edilmesiyle çok sayıda genin transkripsiyonunu etkiliyorsaeptor Rev-erbα 10-15. Heme heme ya da oksijen 16. yanıt olarak, solunum ve oksidatif hasarını kontrol katılan genlerin aktivasyonunda önemli bir rol oynar heme aktivatör protein (Hap) 1 aktivasyonunu düzenler. Heme da 3,17-20 sinyal, sinir büyüme faktörü (NGF) ile nöronal hücrelerde gen transkripsiyonunu düzenler. Ayrıca, hema-regüle eIF2α kinaz (HRI) 21-24 aktivitesini modüle edilmesiyle, memeli eritroid hücrelerde protein sentezini düzenler. Bundan başka, heme uygun hücre fonksiyonu ve hücre büyümesi 4,20,25 için gerekli olan gibi tirosin kinaz Jak2 ve Src gibi anahtar sinyal proteinlerinin aktivitesini etkiler. Bu HeLa hücreleri hema inhibisyonu yaşlanma ve apoptoz 26 ile ilişkili markörler hücre siklüs hapsine ve aktivasyonunu neden olduğu tespit edilmiştir. Heme eksikliği ya da heme artmış düzeyleri her iki insanlarda 27 ciddi sağlık etkileri ile ilişkilidir. Son moleküler and epidemiyolojik çalışmalar yüksek heme alımının pozitif bir ilişki ve bu tip-2 diyabet, koroner kalp hastalığı ve akciğer kanseri, kolorektal kanser ve pankreas kanseri gibi birçok kanser 27,28 olarak hastalıkların riski göstermiştir. Normal ve kanser, akciğer hücreleri yazarların laboratuar eşleşen bir çift kullanarak kanser hücreleri, oksijen tüketimi, hema sentezi ve hem alımı ve oksijen kullanımı 28 yer alan protein düzeylerinde artış olduğunu bulmuşlardır. İlginç bir şekilde, heme sentezinin engellenmesi, oksijen tüketimi, proliferasyonu, kanser hücrelerinin 28 göç ve koloni oluşumu azalmıştır. Böylece endojen Heme seviyelerinde dalgalanmaları, moleküler ve hücresel süreçlerin 3,4,28,29 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar.
Memelilerde, hema grubuna ait biyosentezi mitokondri ve sitosol 4 (Şekil 1) yer alan enzimler içeren, sekiz adımda meydana gelir. Heme biosyntezi ALA sentaz (yazık) 4,31 ile katalize edilmiş 5-aminolevulinik asit (5-ALA) oluşturmak için glisin ve süksinil-CoA kondensasyonu ile mitokondri matris içinde başlar. Bu nonerythroid hücrelerde hem biyosentezi, oranın sınırlandığı aşama olan. 5-ALA ardından sonraki dört adım geri o protoporfirin IX (PPIX) dönüştürülür mitokondri, ithal edilir coproporphyrinogen III (CPgenIII) oluşturmak üzere meydana sitoplazmada dışarı ihraç edilmektedir. Son olarak, demir bir molekülü heme, ferrokelataz (FECH) 2,4 ile katalize edilen bir reaksiyonun üretilmesi için protoporfirin IX (PPIX) için dahil edilmiştir.
hema biyosentezinin seviyesi esas olarak sıkı bir şekilde hücre içi demir ve heme 4 tarafından kontrol ne yazık ki enzim seviyesine bağlıdır. Heme biyosentez genetik bozukluklar, belirli bir mineral ve vitamin (örneğin, riboflavin, çinko), toksinler (örneğin, alüminyum, kurşun maruz kalma durumu etkilenebilir), Bazı steroidler (bir anoksi, ateş, ve düzeyler, örneğin östrojen) 32-35. hema sentezi düzeyi çeşitli hastalıklı koşullarda değiştirilir. Azalmış heme biyosentezi aneminin yanı sıra nörolojik hastalıklar 3,36 neden olabilir. Seçenek olarak ise, artan hem biyosentezi bazı kanser 28,37 ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Heme memeli yağ, eritroid ve nöronal hücrelerin 4,38-41 büyümesi, farklılaşması ve hayatta kalması için kritik olduğu gösterilmiştir. Örneğin, hema eksikliği glutamat NMDA (N-metil-D-aspartat) reseptörü 17 inhibisyonu yoluyla birincil fare kortikal nöronlarda nörit hasarına yol açar. Buna ek olarak, heme sentezinin engellenmesi, insan epitel serviks karsinomu, HeLa hücreleri, 26,41 programlanmış hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, farklı koşullar altında çeşitli hücrelerde hem biyosentezi seviyelerini ölçmek etyoloji ve progressi çalışmaları için önemlidirbirçok hastalığın üzerinde.
Burada [4- 14 C] 5-aminolevulic asit kullanılarak hücre içi heme sentez düzeyini ölçmek için hızlı ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 55 Fe veya 59 Fe kullanan diğer yöntemlere alternatif bir yöntemdir. Onun radyasyon çok zayıf olduğu için biz 14 C kullanmayı tercih. Buna karşılık, güçlü bir koruma Fe izotopları ile çalışmak için gereklidir. Bundan başka, bu yöntem, ölçülmesi ve hızlı bir şekilde paralel olarak, farklı hücrelerde hema sentezi Karşılaştırma amaçlanmıştır. Mutlak heme düzeylerini ölçmek amacıyla, bir HPLC 42,43 kullanımını içeren daha önce kurulmuş yöntemi kullanabilirsiniz.
Heme solunum yoluyla 26 hücresel enerji üretiminde önemli bir rol oynar. Altered heme metabolizması kanseri 28,41 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Hema sentezinin önlenmesi Hela hücreleri 26,41 hücre döngüsü tutuklama ve apoptoza yol açtığı bilinmektedir. Yüksek heme sentez düzeyi akciğer kanseri hücrelerinin 28 ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, farklı koşullar altında hücrelerde hem…
The authors have nothing to disclose.
HCC4017 ve HBEC30KT hücre hatları nazik Dr John Minna laboratuvarında tarafından sağlandı. Bu çalışma Dr Li Zhang Cecil H. ve Ida Yeşil fonları tarafından desteklenmiştir.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |