Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Гем служит простетической группы для широкого спектра белков, известных как гемопротеинов, таких как гемоглобин, миоглобин и цитохромы. Он участвует в различных молекулярных и клеточных процессах, таких как генной транскрипции, трансляции, клеточной дифференцировке и пролиферации клеток. Уровни биосинтеза гема варьироваться в зависимости от различных тканей и типов клеток и изменяется в болезненных состояниях, таких как анемия, невропатии и рака. Эта методика использует [4- 14С] 5-аминолевулиновой кислоты ([14С] 5-АЛК), один из ранних предшественников в пути биосинтеза гема, чтобы измерить уровни синтеза гема в клетках млекопитающих. Этот анализ включает в себя инкубации клеток с [14 C] 5-ALA с последующим экстрагированием гема и измерения радиоактивности, включенного в гема. Эта процедура является точной и быстрой. Этот метод измеряет относительные уровни гем биосинтеза, а не общее содержание гема. Чтобы продемонстрировать использование этого технIQUE уровни биосинтеза гема были измерены в нескольких клеточных линий млекопитающих.
Introduction
Гем, комплекс двухвалентного железа и протопорфирина IX является центральным молекула для транспортировки и использования кислорода практически во всех живых организмах 1-3. Уникальная структура гема позволяет ему функционировать в качестве носителя двухатомных газов и электронов, а также для выполнения других функций 1-5. Например, гем связывается с кислородом гемоглобина и миоглобина для передачи и хранения кислорода 6,7. Она также работает в качестве носителя электронов в цитохромов при дыхании и действует в качестве донора электронов для окислительно-восстановительных реакций, катализируемых ферментов цитохрома P450 8,9. Одним из наиболее важных особенностей является то, что гема, он может играть регуляторную роль в клеточных и молекулярных процессов, таких как транскрипции генов, синтез белка и РНК микро-биогенезе 4. Например, он влияет на транскрипцию многих генов, контролируя активность млекопитающих репрессор транскрипции Bach1 и млекопитающих ядерного RECeptor Rev-erbα 10-15. Гем регулирует активацию гема активатора протеина (НАР) 1, который играет важную роль в активации генов, участвующих в дыхании и контроля окислительного повреждения, в ответ на гема или кислорода 16. Гем также регулирует транскрипцию генов в нервных клетках через фактор роста нервов (ФРН) сигнализации 3,17-20. Он также регулирует синтез белка в эритроидных клетках млекопитающих путем модулирования активности гема регулируется eIF2α киназы (HRI) 21-24. Кроме того, гем влияет на активность ключевых сигнальных белков, таких как тирозин-киназы Jak2 и Src, которые имеют важное значение для нормального функционирования клеток и роста клеток 4,20,25. Было обнаружено, что в клетках HeLa клетки ингибирования гема вызывает остановку клеточного цикла и активацию маркеров, связанных со старением и апоптозом 26. И дефицит Гем или повышенные уровни гема связаны с тяжелыми последствиями для здоровья человека в 27. Последние молекулярнойй эпидемиологические исследования показали положительную ассоциацию высоким потреблением гема и повышенный риск заболеваний, таких как сахарный диабет 2-го типа, ишемической болезни сердца и некоторых форм рака, включая рак легких, колоректальный рак и рак поджелудочной железы 27,28. Используя согласованную пару лаборатории нормальными и раковыми клетками легких авторов показали, что раковые клетки имеют повышенный уровень потребления кислорода, синтеза гема и белков, участвующих в поглощения гема и кислорода утилизации 28. Интересно, что ингибирование синтеза гема уменьшилось потребление кислорода, пролиферацию, миграцию и образование колоний раковых клеток 28. Таким образом, колебание уровней эндогенного гема играет важную роль в регуляции молекулярных и клеточных процессов 3,4,28,29.
У млекопитающих, биосинтез гема происходит в восьми шагов, с участием ферментов, расположенных в митохондриях и цитозоле 4 (рисунок 1). Гем Биосинетезис начинается в матрице митохондрий с конденсацией глицина и сукцинил-КоА с образованием 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), катализируемой ALA-синтетазы (увы) 4,31. Это скорость шаг в гем биосинтеза в клетках nonerythroid ограничения. 5-АЛК затем экспортируется в цитозоль, где в ближайшие четыре шага произойти, чтобы сформировать coproporphyrinogen III (CPgenIII), который затем импортировать обратно в митохондрии, где он превращается в протопорфирина IX (PPIX). Наконец, одна молекула железа включена в протопорфирина IX (PPIX) для получения гем, реакции, катализируемой феррохелатазы (FECH) 2,4.
Уровень биосинтеза гема, зависит прежде всего от уровня ALAS фермента, который жестко контролируется внутриклеточного железа гема и 4. Биосинтез гема могут быть затронуты генетических дефектов, наличие определенных витаминов и минералов (например, рибофлавин, цинк), воздействие токсинов (например, алюминия, свинца), Аноксии, лихорадка, и уровни некоторых стероидов (например, эстроген) 32-35. Уровень синтеза гема изменяется в различных болезненных состояниях. Снижение гем биосинтеза может привести к анемии, а также неврологических заболеваний 3,36. Кроме того, увеличилась гема биосинтеза играет важную роль в прогрессировании некоторых видов рака 28,37. Гем было показано, является критическим для роста, дифференцировки и выживания жировой млекопитающих, эритроидных и нервных клеток 4,38-41. Например, дефицит гема приводит к повреждению нейритов в первичной мыши корковых нейронов через ингибирование глутамата NMDA (N-метил-D-аспартат) рецепторов 17. Кроме того, ингибирование синтеза гема вызывает запрограммированную гибель клеток в человеческой эпителиальной карциномы шейки HeLa клетки 26,41. Таким образом, измерение уровней гема биосинтеза в различных клетках при различных условиях является важным для изучения этиологии и progressiна многих заболеваний.
Здесь мы опишем быстрый и чувствительный метод для измерения уровня внутриклеточного синтеза гема с помощью [4- 14 C] 5-aminolevulic кислоты. Это альтернативный метод с другими методами с использованием 55 или 59 Fe Fe. Мы предпочитаем использовать 14 C, потому что его излучение очень слабое. В отличие от этого, сильная защита требуется для работы с Fe изотопов. Кроме того, этот метод предназначен для измерения и сравнения синтез гема в разных клетках параллельно в быстрой манере. Для того чтобы измерить абсолютные уровни гема, можно использовать ранее установленную способ, включающий использование ВЭЖХ 42,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гем играет ключевую роль в генерации клеточной энергии через дыхание 26. Altered метаболизма гема, как известно, связаны с различными заболеваниями, включая рак 28,41. Ингибирование синтеза гема, как известно, вызывают остановку клеточного цикла и апоптоз клеток HeLa в 26,41. Был?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Клеточные линии HCC4017 и HBEC30KT были любезно предоставлены лаборатории доктора Джона Минны. Эта работа была поддержана за счет средств Сесил Х. и Ида Зеленые доктору Ли Чжан.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
