Summary

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em> In vitro</em> Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Published: August 31, 2014
doi:

Summary

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Abstract

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

Introduction

Om zowel de gastheer en virale kenmerken die invloed HIV-1 pathogenese en progressie van het grootste belang voor rationeel vaccinontwerp. De cellulaire immuunreactie is een belangrijk onderdeel van de menselijke immune reactie op HIV-1 infectie. Cytotoxische T lymfocyten (CTL) zijn nodig voor de eerste controle van acute viremie en laat de host een steady state (set point) viral load 1,2 vestigen. Experimentele depletie van deze effectorcellen leidt tot verlies van virale controle 3,4. Ondanks dit, ontsnappen mutaties ontstaan ​​binnen het virale genoom dat CTL erkenning van viraal geïnfecteerde cellen 5-9 ondermijnen.

Bepaalde HLA allelen zijn geassocieerd met lagere virale lading en tragere progressie van de ziekte zoals B * 57 B * 27 B * 81 en 10-15. Een deel van het beschermende voordeel van HLA klasse I allelen kan worden toegeschreven aan het feit dat ze gericht functioneel beperkte gebieden van het genoom, zoals Gagen selecteren op ontsnappingsmutaties dat het vermogen van het virus om te repliceren in vitro 16-21 verminderen. Hoewel ontsnapping van het cellulaire immuunsysteem is gunstig voor het virus in de context van de selectie HLA klasse I allel, kan het effect van deze mutaties differentiële gevolgen voor de ontvangende upon overbrenging moet een HLA-mismatch individuele 22,23. Daarom is het begrijpen van de effecten van de verzonden-HLA geassocieerd escape mutaties op de virale replicatie capaciteit zal belangrijk zijn om ons begrip van vroege HIV-1 pathogenese bevorderen.

Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij de fitness gebreken van afzonderlijke escape mutaties geassocieerd met specifieke HLA klasse I allelen 24-29 te identificeren en te karakteriseren, natuurlijk voorkomende HIV-1 isolaten zijn unieke en complexe voetafdrukken van HLA-geassocieerde polymorfismen, waarschijnlijk als gevolg van het HLA gemedieerde immuun druk van verschillende immunogenetische achtergronden 30. In apet bestaan ​​analyse Goepfert et al. blijkt dat een accumulatie van HLA-geassocieerde mutaties in het uitgezonden Gag sequenties afgeleid van 88 acuut geïnfecteerde Zambians werd geassocieerd met een vermindering instelling viral load 31. Dit suggereerde dat de overdracht van schadelijke ontsnappingsmutaties, specifiek Gag, HLA-mismatch ontvangers verschaft een klinisch voordeel en kan het gevolg zijn van virale replicatie verzwakt. Moving forward, is het noodzakelijk om te bestuderen hoe complexe combinaties van Gag polymorfismen binnen natuurlijk voorkomende isolaten werken in overleg met de kenmerken van de uitgezonden virus zoals replicatie capaciteit, en hoe vroeg replicatie kunnen op hun beurt van invloed op HIV-1 klinische parameters en de late-fase definiëren pathogenese.

Brockman et al. Eerst een verband tussen de replicatie capaciteit van gag-pro sequenties geïsoleerd tijdens de chronische fase infectie en virale lading in zowel subtype C en B-infecties aangetoond32-35. De experimentele benadering gepresenteerd in deze studies, hoewel geschikt voor de behandeling van in vitro replicatie aantal sequenties, verkregen uit chronisch geïnfecteerde individuen, heeft verschillende technische restricties en beperkingen maken het bestuderen van HIV-1 replicatie capaciteit subtype C acuut geïnfecteerde individuen moeilijk. Deze werkwijze berust op de recombinatie van populatiegebaseerde PCR-geamplificeerde sequenties in de subtype B NL4-3 provirus, dat gedeeltelijk afgeleid van LAV, een laboratorium aangepaste virus stock 36. Virusproductie werd bewerkstelligd door co-transfectie van een CEM-gebaseerde T-cellijn 37 met PCR amplicons en gedigereerd delta gag-pro NL4-3 DNA. Deze methode vereist de uitgroei van virus gedurende weken tot maanden, eventueel vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock betrekking tot de virale quasispecies in vivo, en derhalve het veranderen van de meting van replicatie capaciteit in vitro. Deze methode is meer geschikt voor het bestuderen van chronisch geïnfecteerde individuen, waar het effectief kiest voor virus met de hoogste replicatieve capaciteit, en wanneer kloneren tal verschillende virale varianten van een groot aantal chronisch geïnfecteerde individuen is vrij arbeidsintensief en derhalve nog niet. Echter, in een acuut geïnfecteerde individu er doorgaans 01:59 varianten aanwezig, en zo het risico van vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock elimineren, door in vitro selectie drukken, zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van de in vitro replicatie capaciteit. Tweede methode vereist recombineren subtype C gag-pro-sequenties in een subtype B afgeleide ruggengraat en kan backbone onverenigbaarheid biases in de analyse introduceren. Vanwege deze beperkingen moeten grote aantallen sequenties worden geanalyseerd om mogelijke vertekeningen ingevoerd overwinnen.

Hier beschrijven we een alternatieve experimentele voorkomendach geschikt voor het bestuderen van sequenties afgeleid van subtype C acuut geïnfecteerde individuen. We gebruiken een restrictie-enzym gebaseerde klonering strategie het gag gen afgeleid van acute infectie tijdstippen van HIV-1 subtype C geïnfecteerde individuen in het subtype C provirale backbone, MJ4 voeren. Het gebruik van MJ4 als gemeenschappelijke backbone waarin gag genen kloneren cruciaal voor de analyse van het subtype C afgeleide sequenties. MJ4 is afgeleid van een primair isolaat 38, en zou dus minder waarschijnlijk vertekening door subtype incompatibiliteit tussen de hoofdketen en gag gen. Bovendien is de benadering van het gebruik van restrictie-enzymen gebaseerde klonering maakt de provirale constructen rechtstreeks in 293T-cellen worden getransfecteerd, en voor het herstel van een klonale virus stock identiek aan de gekloneerde sequentie gag.

De methode hieronder weergegeven is een high throughput methode voor het beoordelen van de replicatie capaciteit van subtype C afgeleid Gag-MJ4chimère virussen. Transfectie in 293T-cellen is eenvoudig en terugwinning van virus duurt slechts drie dagen. In vitro replicatie capaciteit getest op dezelfde CEM-CCR5 gebaseerde T-cellijn door Brockman e.a.. 37, maar met belangrijke protocol aanpassingen noodzakelijk voor een succesvolle replicatie subtype C MJ4 chimere virussen. Het gebruik van een geschikte T-cellijn plaats PBMC maakt grote aantallen subtype C MJ4-chimere virussen te testen met hoge assay reproduceerbaarheid. Ten slotte, wordt een radioactief reverse transcriptase assay voor het kwantificeren van virus in het supernatant kosteneffectiever dan met commercieel verkrijgbare p24 ELISA kits. Het geeft ook een hoger dynamisch bereik, die belangrijk zijn voor het detecteren zowel slecht en zeer replicerende virussen binnen dezelfde assay en voor het detecteren van subtiele verschillen in replicatie tussen isolaten.

De conclusie is dat de hier gepresenteerde methode toegestaan ​​voorde grondige studie van de replicatie capaciteit van gag sequenties afgeleid van HIV-1 subtype C acuut geïnfecteerde individuen uit Zambia, en zoals geschreven, kan ook worden uitgebreid naar andere subtype C geïnfecteerde populatie te bestuderen. Een hoge mate van variatie in replicatie capaciteit tussen verschillende Gag isolaten waargenomen. Daarnaast konden we een statistisch verband tussen de replicatie capaciteit van het verzonden Gag en setpoint viral load als met CD4 + daling vertonen gedurende een periode van drie jaar 39. Dergelijke resultaten benadrukken het belang van het bestuderen van hoe doorgelaten virale kenmerken, zoals replicatie capaciteit, interactie met de gastheer immuunsysteem pathogenese beïnvloeden tijdens de vroege infectie en integraal voor het ontwikkelen van effectieve interventies vaccin evenals de behandeling zal zijn.

Protocol

1 Versterking van de HIV-1 gag Gene uit Infected, Frozen Plasma Uittreksel viraal RNA in 140 gl ontdooid HIV-1 geïnfecteerde plasma middels een extractie kit. Indien haalbaar, onmiddellijk overgaan tot cDNA-synthese na RNA-extractie als onbevroren viraal RNA levert de beste versterking resultaten. Indien mogelijk ingesteld PCR Master Mix voor de eerste ronde van DNA amplificatie en bewaar bij 4 ° C voordat viraal RNA extractie. Reverse transcriptie-cDNA uit RNA en ampli…

Representative Results

Om dit protocol, dat een proviraal plasmide in staat is het monteren van een volledig functionele, besmettelijke Gag-MJ4 hersenschimmen creëert goed uit te voeren, moet grote zorg worden genomen om de geschikte PCR amplicons genereren. Bepalen of de PCR de juiste maat gag amplicon heeft gegenereerd is cruciaal. Producten moeten binnen 100 basenparen (bp) van de ongeveer 1.700 bp amplicon weergegeven in figuur 1A. De exacte lengte van dit fragment is afhankelijk van het gag-gen onder s…

Discussion

Door de lengte en de technische aard van dit protocol, zijn er verschillende stappen die kritiek zijn voor zowel de succesvolle constructie van chimere Gag-MJ4 plasmiden en voor kwantificering van virale replicatie capaciteit zijn. Hoewel het restrictie-enzym gebaseerde klonen strategie voor de invoering van buitenlandse gag genen in MJ4 beschreven in dit protocol heeft tal van voordelen ten opzichte van eerder gebruikte recombinatie gebaseerde methoden, kan het protocol technisch uitdagend zijn als kritische s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The investigators thank all the volunteers in Zambia who participated in this study and all the staff at the Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka who made this study possible. The investigators would like to thank Jon Allen, Smita Chavan, and Mackenzie Hurlston for technical assistance and sample management. We would also like to thank Dr. Mark Brockman for his discussions and generous donation of the GXR25 cells.

This study was funded by R01 AI64060 and R37 AI51231 (EH) and the International AIDS Vaccine Initiative. This work was made possible in part by the generous support of the American people through the United States Agency for International Development (USAID). The contents are the responsibility of the study authors and do not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government. This work also was supported, in part, by the Virology Core at the Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC and JP were supported in part by Action Cycling Fellowships. This work was supported in part by the Yerkes National Primate Research Center base grant (2P51RR000165-51). This project was also funded in part by the National Center for Research Resources P51RR165 and is currently supported by the Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Materials

Name of the Reagent Company Catalogue number Comments
PCR reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagInnerF1:
5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'
IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
BclIDegRev2:
5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'
IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
CoolRack PCR 96 XT Biocision BCS-529
CoolRack M15 Biocision BCS-125
Nuclease free water Fisher SH30538FS Manufactured by Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap) Daigger EF3647BX
SuperScript III one-step RT-PCR system Life Technologies/Invitrogen 12574035
Phusion Hot-start II DNA polymerase Fisher F-549L 
PCR Nucleotide Mix Roche 4638956001
Agarose, high gel strength Fisher 50-213-128
TAE 10X Life Technologies/Invitrogen AM9869
Promega 1kb DNA ladder Fisher PRG5711 Manufactured by Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10000x Life Technologies/Invitrogen S33102
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Razor blades, single-edged Fisher 12-640 Manufactured by Surgical Design
Thermocycler, PTC-200 MJ Research
Microbiology & Cloning reagents
LB Agar, Miller Fisher BP1425-2
LB Broth, Lennox Fisher BP1427-2
Sterile 100mm x 15mm polystyrene petri dishes Fisher 08-757-12
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-5G
Falcon 14ml Polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
NgoMIV restriction endonuclease New England BioLabs R0564L
BclI restriction endonuclease New England BioLabs R0160L
HpaI restriction endonuclease New England BioLabs R0105L
T4 DNA Ligase, 5U/μL Roche 10799009001
JM109 competent cells, >10^8 cfu/μg  Promega L2001
PureYield plasmid miniprep system Promega  A1222
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Cell culture reagents
Amphyl cleaner/disinfectant Fisher 22-030-394
Fugene HD, 1 mL VWR PAE2311 Manufactured by Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268-5G
Costar Plates, 6-well, flat Fisher 07-200-83 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 24-well, flat Fisher 07-200-84 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 96-well, round Fisher 07-200-95 Manufactured by Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm^2 Fisher 10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm^2 Fisher 10-126-34 Manufactured by Corning Life
Conical Tubes, 50ml, blue cap Fisher 14-432-22 Manufactured by BD Biosciences
Conical Tubes, 15ml, blue cap Fisher 14-959-70C   Manufactured by BD Biosciences
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CI Manufactured by Mediatech
RPMI, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11875-119
DMEM, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11965-118
Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100X Life Technologies/Invitrogen 10378-016
PBS with magnesium and calcium, 500ml Life Technologies/Invitrogen 14040-133
PBS without magnesium and calcium Life Technologies/Invitrogen 20012-050
Sarstedt tubes, assorted colors Sarstedt 72.694.996
Reservoir Trays for Multichannel, 55ml Fisher 13-681-501
DEAE-Dextran Fisher NC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate Fisher 07-200-96 Manufactured by Corning Life
HEPES, 1M Buffer Solution Life Technologies/Invitrogen 15630-080
FBS, Defined, 500 ml Fisher SH30070 03
X-gal VWR PAV3941 Manufactured by Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2O Sigma-Aldrich G6257-100ML
1M Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich M1028-100ML
Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5% Sigma-Aldrich F8775-500ML
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich P9387-100G
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich P8131-100G
Allegra X15-R centrifuge Beckman Coulter 392932
TC10 automated cell counter Bio-Rad 1450001
VistaVision inverted microscope VWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay reagents
dTTP, [α-33P]- 3000Ci/mmol, 10mCi/ml, 1 mCi Perkin-Elmer NEG605H001MC
1M Tris-Cl, pH 8.0 Life Technologies/Invitrogen 15568025 Must be adjusted to pH 7.8 with KOH
2M potassium chloride (KCl) Life Technologies/Invitrogen AM9640G Adjust to 1M solution
0.5M EDTA Life Technologies/Invitrogen 15575-020
Nonidet P40 Roche 11333941103
Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt  Midland Reagent Co. P-3001
Oligo d(T) primer  Life Technologies/Invitrogen 18418-012
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small Perkin-Elmer 7001485
Corning Costar Thermowell 96 well plate model (M) Polycarbonate Fisher 07-200-245 Manufactured by Corning Life
Corning 96 Well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Fisher 07-200-684 Manufactured by Corning Life
DE-81 anion exchange paper Whatman 3658-915
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-1KG
Sodium Chloride Fisher S671-3
Autoradiography cassette Fisher FB-CA-810
Cyclone storage phoshpor screen Packard

References

  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208 (2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424 (2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033 (2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018 (2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung’u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041 (2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan … [et al.]. 12 (Unit 12 15), .
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Play Video

Cite This Article
Claiborne, D. T., Prince, J. L., Hunter, E. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (90), e51506, doi:10.3791/51506 (2014).

View Video