Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em> Xenopus</em> Yumurta Özü
Summary
Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır.
Abstract
Xenopus laevis yumurta ekstresi. Xenopus yumurta özü, hücre döngüsü ve sinyal transdüksiyon yollarının 1-3 dahil olmak üzere birçok hücresel bağlamlarda protein dönüşümünü incelemek için kullanılmıştır çeşitli hücresel süreçlerin biyokimyasını incelemek için iyi karakterize edilmiş sağlam bir sistemdir. Burada, bir yöntem olup, Wnt yolu kritik bir bileşen, β-katenin degradasyonunu teşvik etmek için optimize edilmiştir Xenopus yumurta özü izole edilmesi için anlatılmıştır. Iki farklı yöntem Xenopus yumurta özü β-katenin protein degradasyonunu değerlendirmek için tarif edilmiştir. Diğer hali hazırda daha yüksek verimlilik deneyleri (ateş böceği lusiferaz etiketli füzyon proteinleri) için ölçekli bir yöntem ise, ([35 S]-radyo-etiketli proteinleri) görsel olarak bilgilendirici. Açıklanan teknikler β-katenin protein ciro değerlendirmek ve ciro katkıda molekül bileşenleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Buna ek olarak, öğrendiğilusiferaz etiketli proteinlerin sayısal ve kolay okuma ile birlikte homojen bir Xenopus yumurta ekstresi geniş hacimli arındırmak için ity bu sistem kolaylıkla β-katenin bozulmasının modülatörler için yüksek miktarda madde taraması için adapte edilmesine olanak sağlamaktadır.
Introduction
Xenopus laevis yumurta özü sitoskeletal dinamikleri, nükleer montaj ve ithalat, apoptoz, ubikuitin metabolizması, hücre döngüsü ilerlemesi, sinyal iletimi, ve protein cirosu 1-17 dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Yumurta özü aslında bu süreçleri yürütmek ve soruşturma sağlamak için gerekli tüm temel sitoplazmik bileşenleri içeren sulandırılmamış sitoplazmasını temsil ettiği Ksenopus yumurta özü sistem hücresel süreçlerin bir lejyon biyokimyasal analiz için uygun değildir. Yumurta ekstresi büyük miktarlarda malzeme (örneğin, protein saflaştırma veya yüksek verimli tarama) 18-20 büyük miktarlarda ihtiyaç biyokimyasal manipülasyonlar için aynı anda hazırlanabilirler. Diğer bir avantajı Xenopus yumurta özü spesifik protein konsantrasyonu tam olarak yeniden birleştirici protein ve / veya imüno-endog eklenmesi ile ayarlanabilir olmasıdırilgilenilen proteinin ekspresyonu kontrol etmek zordur, plazmid DNA transfeksiyonu aksine enous proteinleri. Buna ek olarak, mevcut rekombinant proteinlerin eksikliği eksogen olarak ilave mRNA çevirmek için taze hazırlanmış Xenopus yumurta ekstrakte yüksek kapasiteli yararlanarak, ilgi konusu proteini kodlayan transkriptlerin eklenmesi ile aşılabilir.
Protein degradasyon düzenleme pek çok hücresel yollarının kontrolü için kritiktir ve 21,. Xenopus yumurta özüt sistem, transkripsiyon ve çevirinin karıştırıcı etki olmadan protein devir izlemek için çok sayıda yollar sağlar gibi protein degradasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır işler. Wnt sinyal yolu hastalığı geliştirme ve kritik roller oynayan bir yüksek ölçüde korunmuş bir sinyal yoludur. Β-katenin, Wnt yolu en önemli effektör devir, son derece artan bir kalıcı-hal yarım litre, veβ-katenin evel Wnt hedef genlerin aktivasyonu için kritiktir. Β-katenin bozulması önemi β-katenin bozulmasını engelleyen Wnt yolu mutasyonlar ~ kolorektal kanser 22 tüm sporadik vakaların% 90 olarak bulundu gerçeği ile vurgulanır. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması sadık olarak ciro mekanizması çalışma yanı sıra bozulma 2, 19, 20, 23-29 e ait yeni küçük moleküllü modülatörlerini tanımlamak için Xenopus yumurta özü değinmeyecek edilebilir.
Hücre döngüsü incelemek için Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanması için yöntemler önceki yayınlarda JoVE 30-32 'de tarif edilmiştir. Mevcut protokol bu yöntemlerin bir modifikasyonunu açıklar ve bozulması için optimize edilmiştir [35 S]-radyo işaretli β-katenin ve lusiferaz etiketli β-katenin inXenopus yumurta özü. Radyo-etiketli bozulma deney otoradyografi ile protein seviyelerinin doğrudan görselleştirme için izin verir. [35 S] methionine daha sonra doğrudan bir bozulma reaksiyona ilave edilebilir bir in vitro çeviri reaksiyonu kullanılarak, ilgi konusu proteine dahil edilebilir. Buna ek olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş protein devir tahlili protein istikrarı etkileyebilir ilgilenilen protein veya bir epitop etiketi, karşı bir antikor gerektirmez. Protein düzeylerindeki küçük değişikliklerin bile, radyo-etiketli protein bandının yoğunluğundaki değişiklikler yansıtılan kolaylıkla otoradyografi ile görselleştirilmektedir için, [35 S]-radyo işaretli bozunma protein tahlili devir 2 görselleştirilmesi için çok yararlı bir yöntemi temsil eder.
Amacıyla, ateşböceği lusiferaz için β-katenin Fusion (bundan sonra sadece "lusiferaz" olarak anılacaktır), protein düzeylerinin kesin ve kolay nicel de elde edilebilirβ-katenin devir 19, 20 kinetik özelliklerini belirlemek için. Lusiferaz deneyi önemli bir avantajı kolay bir şekilde ölçeklenir güçlü bir kantitatif sistem sağlamasıdır. Aşağıdaki protokol β-katenin bozulmasını ve yeni β-katenin modülatörlerinin, yüksek miktarda madde taraması için sağlam, etkin ve etkili bir yöntem test etmek için basit bir yöntem sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus yumurta özü β-katenin ciro araştırmak için sağlam bir biyokimyasal sistemidir. Xenopus yumurta özü β-katenin konsantrasyonu ~ 25 nM 2'dir. Uygun koşullar altında, yumurta özü 50-100 nM / st 'lik bir oranda β-katenin parçalama yeteneğine sahip olan ve 200 nM, 24 yarı-maksimumdur. Xenopus yumurta özü kullanılarak β-katenin bozulması başarılı sulandırma için birkaç önemli adım vardır. Bu yüksek kaliteli Xenopus yumurt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma için Laurie Lee teşekkür ederiz. TWC bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral Kardeşliği (12PRE6590007) tarafından desteklenmektedir. MRB Ulusal Kanser Enstitüsü eğitim bursu (T32 CA119925) tarafından desteklenmektedir. SSH Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK078640) tarafından desteklenmektedir. EL Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM081635 ve R01GM103926) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It’s about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3’s phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
