Reconstituição de β-catenina degradação na<em> Xenopus</em> Extrato de ovo

Summary

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

Abstract

Xenopus laevis extracto de ovo é, um sistema robusto bem caracterizado para estudar a bioquímica de diversos processos celulares. Xenopus extracto de ovo foi utilizada para estudar a rotatividade de proteínas, em muitos contextos celulares, incluindo o ciclo de célula e de transdução de sinal de caminhos ^1-3. Aqui, é descrito um método para o isolamento de Xenopus extracto de ovo que foi optimizada para promover a degradação do componente da via Wnt crítico, β-catenina. Dois métodos diferentes são descritas para avaliar a degradação das proteínas β-catenina no Xenopus extracto de ovo. Um método é visualmente informativo ^([35 S]-radiomarcado proteínas), enquanto o outro é mais facilmente dimensionado para ensaios de elevado rendimento (firefly proteínas de fusão de luciferase-marcada). As técnicas descritas podem ser utilizadas para, mas não estão limitados a, avaliar retorno da proteína β-catenina e identificar componentes moleculares que contribuem para a sua rotação. Além disso, a capacidade para purificar grandes quantidades de extracto de ovo de Xenopus homogénea combinada com a leitura quantitativa e fácil de proteínas marcadas-luciferase permite que este sistema possa ser facilmente adaptado para o rastreio de alto rendimento para moduladores da degradação β-catenina.

Introduction

Xenopus laevis extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar muitos processos biológicos celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, montagem e importação nuclear, apoptose, metabolismo ubiquitina, a progressão do ciclo celular, transdução de sinal, e turnover de proteína ^1-17. O sistema de extrato de ovos de Xenopus é passível de análise bioquímica de uma legião de processos celulares porque extrato do ovo representa essencialmente citoplasma não diluído que contém todos os componentes citoplasmáticos essenciais necessários para executar esses processos e permitir investigação. Grandes quantidades de extracto de ovo, podem ser preparados ao mesmo tempo para manipulações bioquímicas que requerem grandes quantidades de material (por exemplo, a purificação de proteínas ou de triagem de alto rendimento) ^18-20. Outra vantagem é que a concentração de proteínas específicas em Xenopus extracto de ovo pode ser ajustada com precisão por adição de proteína recombinante e / ou de imunodepleção endogproteínas enous em contraste com a transfecção do plasmídeo de DNA em que a expressão da proteína de interesse é difícil de controlar. Além disso, a ausência de proteínas recombinantes disponíveis pode ser eliminada pela adição de transcritos que codificam a proteína de interesse, tomando vantagem da elevada capacidade do extracto de ovo de Xenopus recentemente preparada para traduzir o mRNA exogenamente adicionado.

A regulação da degradação de proteínas é fundamental para o controle de muitas vias celulares e processa ^21. Xenopus extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar a degradação de proteínas como o sistema permite várias maneiras de monitorar turnover de proteína, sem influências de confusão de transcrição e tradução. A via de sinalização Wnt é uma via de sinalização altamente conservada, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na doença. O volume de negócios de β-catenina, o principal efetor da via Wnt, é altamente regulado, e um aumento do estado de equilíbrio level de β-catenina é fundamental para a ativação de genes alvo de Wnt. A importância da degradação β-catenina é realçada pelo facto de que as mutações na via de Wnt que inibem a degradação β-catenina em ~ 90% de todos os casos esporádicos de cancro colorrectal ^22. degradação β-catenina por componentes da via Wnt podem ser fielmente recapitulado em Xenopus extracto de ovo para estudar o mecanismo da sua rotação, assim como para identificar novos moduladores de pequenas molécula do seu degradação ^{2, 19, 20, 23-29.}

Os métodos para a preparação do extracto de ovo de Xenopus para o estudo do ciclo celular têm sido descritos nas publicações anteriores JoVE ^30-32. O actual protocolo descreve uma modificação destes métodos e é optimizado para a degradação de ^[35 S]-radiomarcado β-catenina e marcaram-luciferase β-catenina emExtrato de ovos de Xenopus. O ensaio de degradação radiolabeled permite a visualização direta dos níveis de proteína através de auto-radiografia. ^[35 S]-metionina incorporada na proteína de interesse, utilizando uma reacção de tradução in vitro, que pode então ser directamente adicionado a uma reacção de degradação. Além disso, o ensaio de retorno da proteína marcada radioactivamente não requer um anticorpo contra a proteína de interesse ou um epitopo marcador, o qual pode influenciar a estabilidade da proteína. Porque até mesmo pequenas mudanças nos níveis de proteína, como reflectida em alterações na intensidade da banda de proteína marcada radioactivamente, são prontamente visualizados por auto-radiografia, o ^[35 S]-radiomarcado ensaio de degradação representa um método muito útil para a visualização da proteína volume ^2.

Fusão de β-catenina a luciferase de vaga-lume (adiante designado simplesmente como "luciferase") permite medições quantitativas precisas e fáceis de níveis de proteína, a fimpara determinar as propriedades cinéticas de rotação β-catenina ^{19, 20.} Uma grande vantagem do ensaio de luciferase é que ela proporciona um sistema forte quantitativa que pode ser facilmente dimensionada para cima. O protocolo seguinte fornece métodos simples para ensaiar a degradação β-catenina e um método robusto e eficiente, e eficaz para o rastreio de alto rendimento de novos moduladores β-catenina.

Protocol

1. Preparação do extrato do ovo Xenopus NOTA: Cada sapo produz cerca de 1 ml de extrato de ovo utilizável. Extratos de 10 rãs são normalmente preparados ao mesmo tempo, eo volume de tampão descrito abaixo é para realizar a 10 sapo Xenopus extrato do ovo de preparação. O volume do tampão pode ser ajustada em conformidade, para preparações maiores ou mais pequenas de extracto de ovo. Preps gerados desta maneira consistente originar concentrações de proteína ≥ 5…

Representative Results

Um esquema de degradação β-catenina no Xenopus extracto de ovo é mostrado na Figura 2A. 35S-marcado β-catenina foi incubada em Xenopus extracto de ovo, aliquotas (1 ml de extracto equivalente) foram removidos em tempos apropriados, e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE seguido por autorradiografia. degradação β-catenina por componentes da via Wnt é mediada pelo sistema de ubiquitina-proteassoma 2, e a degradação de [35 S]-radiomarcado β-…

Discussion

Xenopus extrato do ovo é um sistema bioquímico robusta para investigar rotatividade β-catenina. A concentração de β-catenina no Xenopus extracto de ovo é de ~ 25 nM ^2. Sob condições ideais, o extracto de ovo é capaz de degradar β-catenina, a uma taxa de 50-100 nM / h e é metade do máximo a 200 nm ^24. Há vários passos críticos para a reconstituição bem sucedida de degradação β-catenina usando Xenopus extrato do ovo. Estes incluem: 1) a geração de alt…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium Chloride	Fisher	BP366-1
Sodium Chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500
Calcium Chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 mL syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27G1 needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo Luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 mL Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-Firefly Luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
Name of Equipment	Company
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific
16°C Incubator	Percival Scientific