assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.
ההטרוגניות של אוכלוסיית תאי גזע פוגעת בהבנה מפורטת של ביולוגיה של תאי גזע, כגון הנטייה הבידול שלהם כלפי שושלות שונות. Assay transcriptome התא בודד יכול להיות גישה חדשה ללנתח וריאציה בודדת. פיתחנו שיטת qRT-PCR תא הבודד, ואישרתי כי שיטה זו עובדת היטב במספר פרופילי ביטוי גנים. ברמת תא בודדת, כל תא גזע עוברי אנושי, מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים EGFP, יש ביטוי גבוה בOct4, אבל רמת ביטוי Nanog שונה. assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי לחקור heterogeneities אוכלוסייה.
אוכלוסיות eukaryote רוב גבוהות יותר הן הטרוגנית וכך עם ניתוח של אוכלוסייה נקוותה, הוא לעתים קרובות קשה לפרש תכונות הסלולריות שלהם. תאים בודדים בתוך אוכלוסייה עשויים להיות מעט שונים, והבדלים אלה יכולים להיות השלכות חשובות עבור הנכס והתפקוד של כל האוכלוסייה 1, 2. במיוחד, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ידועים להיות הטרוגניות, מה שגורם לרמות שונות של pluripotency ופוטנציאלים מגוונים למפרט שושלת בעדינות דרכים ייחודיות 3, 4. לדוגמא, ניתן להשתמש בם פני השטח אנטיגנים תא שונים כדי לסווג את תאי גזע pluripotent מובחנים, 5 וקבוצת אוסטין סמית מוצעת רמות שונות של pluripotency בתאי גזע העובריים של עכברים, המבוססים על המורפולוגיה, הנטייה והתלות של מסלול איתות 6 הבידול שלהם. תופעה זו הייתה שיערו בעובר אנושיתאי גזע NIC 7. בעוד שהמחקרים הכוללים בוצעו בין קווים שונים בתאי גזע, ולא בתאי גזע אחד בודדים, זה יכול להיות מאוד מעניין לנתח את הרמות של pluripotency שונים ברמת התא הבודד, אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על יכולות ההבחנה שלהם כלפי כל שושלות התאים סומטיים.
הטרוגניות תאית ומולקולרית יכולה להיות מוכתבת על ידי פרופיל שעתוק, אשר נקראה "transcriptome התא הבודד 'ומדגישה גישות חדשות לכימות רמות ביטוי הגנים 8-10. לניתוח של רמות ביטוי הגנים בתאים בודדים, פיתחנו פרוטוקול פשוט, אבל חזק של תא הבודד RT-PCR. אנחנו אישרו את היעילות ואת הכדאיות של הפרוטוקול שלנו על ידי השוואת כל מחצית lysates תא הבודד, כמו גם RNAs הכולל דילול סדרתי של hESCs, וכתוצאה מוריאציות טכניות מינימליות והבדלים. יתר על כן, אנו משמשים קו כתב גנטי לבודד עמ הומוגניתopulation של hESCs באמצעות מערכת מיקוד גן. הווקטור התורם למיקוד לוקוס Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro לבנות) וזוג פלסמידים Talen שימש 11. וקטור התורם וזוג פלסמידים Talen הוכנסו hESCs (H9, WA09) באמצעות nucleofection ופרוטוקול בחירה משובט והתחזוקה של hESCs בוצע על בסיס פרוטוקול השגרה שלנו 12. אנחנו אישרו שורת כתב זה גנטי לבטא EGFP לביטוי Oct4 בOct4 :: EGFP hESCs.
התוצאה שלנו מוכיחה כי hESCs הבודד (מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים מאוד EGFP) להחזיק רמות גבוהות של ביטוי Oct4, אבל רמות של ביטוי Nanog שונות. לכן, assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי ללמוד heterogeneities אוכלוסייה של תאי גזע pluripotent.
פרופיל גנטי תא בודד יכול להיות כלי עיקרי לחזות את הפונקציונליות של תא בודד או אוכלוסייה שלמה. עקב מגבלות טכניות, ניתוח פרופיל הגנטי כולו הוגבל לממוצע אוכלוסייה. שינויים בדפוסי ביטוי גנים והרמות בין תאים הבודדים והאוכלוסיות הוצעו לגרום לפרשנות מוטעה. ניתן למצוא היבט?…
The authors have nothing to disclose.
אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).
96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |